Slayt 1 - XXVII. Ulusal Biyokimya Kongresi / 3
Transkript
Slayt 1 - XXVII. Ulusal Biyokimya Kongresi / 3
LC-MS/MS İLE KOLŞİSİN ÖLÇÜM YÖNTEMİNİN VALİDASYONU Uzm.Dr .Tevfik HONCA SUNUM PLANI • • • • • • GİRİŞ ve AMAÇ GENEL BİLGİLER GEREÇ ve YÖNTEM BULGULAR TARTIŞMA SONUÇ ve ÖNERİLER GİRİŞ • Kolşisin, Lily familyasından Colchicum Autumnale (Acı Çiğdem) ve Zambakgillerden Gloriosa superba bitkilerinin bir alkaloid derivesidir. • Çiçekler morumsu pembe renkli olup, altı lobludur. • Bitkideki alkaloidlerin çoğu amid yapılı ve çok zayıf bazik karakterli ve nötraldir. • Kolşisinin azotu halka dışındadır ve bir asetamid şeklinde teşkil etmiştir. • Burada tropolon bir keton grubu taşıyan 7 üyeli ve doymamış bir halkadır. 4 metoksil grubunun 3’ü benzen, 1’i tropolon halkasına bağlanmıştır. • Kolşisin benzen ve tropolon halkası taşır ve bu iki halka arasında 53 derecelik bir bükülme vardır. Bu eğim molekülün tübülinle bağ oluşturabilmesi için gereklidir. • Bu bağ mikrotübülinlerin oluşmasını engeller ve alkoloidin antimitotik aktivitesinden sorumludur. • Kolşisin mitotik ipliklerin oluşumunu engelleyerek, metafaz safhasında mitozu bloke eder. GENEL BİLGİLER • Kolşisin trisiklik, yağda çözünen bir alkaloid olup ana aktivasyonu etkisi; mikrotübül polimerizasyonunun inhibisyonudur. • Mikrotübüller hücre iskeletini oluşturan ana protein filamanlarıdır ve pek çok aktivitenin düzenlenmesinden sorumludurlar. • Mikrotübüller sitoplazma boyunca uzanan uzun rijit polimerlerdir • Her mikrotübül yüksek labilite ve değişik antimitotik yapılara sensitif, α ve β tübülün heterodimerlerinden oluşmaktadır. • Her kolşisin molekülü bir tübülin molekülüne bağlanır ve polimer oluşumunu önlemeye çalışır. • Mikrotübül oluşumu durur, mitotik uç hasarlanır ve hücre bölünmesi devam edemez. • Hücre iskeletinin oluşumunun hasarlanmasıyla, kolşisinin intrasellüler vezikül motilitesini, sitokinler ve kemokinler gibi endojen mediatörlerin de salınımı önlenebilmektedir. • Kolşisin yıllar boyunca gut, psödogut ve ailevi Akdeniz ateşi (AAA) tedavisinde kullanılmıştır. • Bitkinin farmakolojik komponenti 1820 yılında izole edilmiştir ve 1883 yılında saf formu oluşturulmuştur ve kolşisin adı verilmiştir. • 2009 yılında US Food and Drug Administration (FDA) tarafından ilacın onaylanmasıyla güvenilir şekilde uygulanmaya başlamıştır. • Kolşisinin sağlıklı gönüllülerde 15 gün boyunca günlük verilen oral 1mg dozuyla, plazma seviyeleri 5 gün içerisinde stabil düzeylere ulaşmaktadır ve 0,7- 1,4 ng/mL düzeyine gelmektedir. • Kolşisin etkileri plazmadan ziyade lökositlerdeki konsantrasyonuyla ilişkili olmasına rağmen kolşisin terapisi altındaki hastalarda plazma ölçüm yöntemleri, düşük intestinal absorbsiyon, yüksek riskli toksisite ve tedaviye zayıf yanıt durumlarında yararlı olmaktadır. • Doz bağımlı kolşisin etkileri akut kolşisin zehirlenmesinden kaynaklanmaktadır ve yüksek bir mortalite oranına sahiptir. Terapotik İndeks • 0.5mg/kg’dan daha düşük olarak enjekte edilen dozlar gastrointestinal semptomlara ve pıhtılaşma faktör eksikliklerine yol açmaktadır. • 0.5-0.8mg/kg doz oranları kemik iliği yetmezliğine sebep olabilir ve %10 düzeylerinde mortaliteye yol açabilir. • 0.8 mg/kg üzerinde bir enjeksiyon ölüme yol açabilir. • Terapötik dozlar 0.015’ten 0.030 mg/kg’a uzanabilir. • Terapötik indeksi dardır. Kolşisin ölçümünde kullanılan yöntemler • Ultra-high performance liquid chromatography (Uhplc) • (GC/MS) • Turbulent flow LC-MS/MS • Charcoal adsorption assay for measurement of colchicine GEREÇ ve YÖNTEM • Hastalardan analiz için gerekli olan kan örnekleri 8-12 saat açlığı takiben sabah 9:00-11:00 saatleri arasında alındı. • Kan örnekleri EDTA içeren mor kapaklı tam kan tüplerine alındıktan sonra 4 °C’de 4000 rpm’de 10 dakika santrifüj edildi. • Daha sonra plazma örnekleri ayrılıp eppendorf tüplerine alınarak çalışma gününe kadar -80 °C’de saklandı. • Bu örnekler çalışma gününe kadar gün ışığından korundu. Kullanılan Kimyasal Maddeler Kolşisin (saflık> %99.5) Sigma (A.B.D.) Izopropil alkol Merck (Almanya) Diklormetan Merck (Almanya) Metanol (HPLC grade) Merck (Almanya) Asetonitril (HPLC grade) Merck (Almanya) Trikloroasetik asit (TCA) Merck (Almanya) Etilasetat Merck (Almanya) Amonyum Asetat Merck (Almanya) Formik Asit Merck (Almanya) Tegafur (saflık> %99.5) DRG Ins. (Almanya) Kullanılan Cihazlar Ve Malzemeler • Ultra Hızlı Sıvı Kromatografisi (UFLC) Sıralı Kütle Spektrometresi (MS/MS) Cihazı Ve Ekipmanlari – – – – – – – – Otomatik örnekleme sistemi: Shimadzu Prominence SIL-20AC HT, Shimadzu Technologies, Japan. Paralel Tipte Çiftli Pompa: Shimadzu Prominence, LC-20AD Shimadzu Prominence, Shimadzu Technologies, Japan. Degasser: Shimadzu Prominence, DGU-20A5, Shimadzu Technologies, Japan. Kolon Fırını: Shimadzu Prominence, CTO-10 AS VP, Shimadzu 1200, Shimadzu Technologies, Japan. Mikroişlemci: AB SCIEX for LC. Yazıcı: Xerox Phaser 3140. Sıralı Kütle Spektrometresi: Applied Biosystems Sciex API 3200 QTrap mass spectrometer (Applied Biosystems Sciex, Ontario, Canada) Iyonizasyon Modu: Elektrospray İyonizasyon (ESI) Kullanılan Cihazlar Ve Malzemeler • Analitik Kolon – C18 hidrokarbon zincirine bağlı silika içeren, partikül büyüklüğü 5 µm olan 4.6 x 150 mm boyutlarındaki ODS-3 ters faz kolon (ACE C18 kolon 5 µm, 150 mm×4.6 mm i.d). • Guard Kolon: – Phemomenex ODS-3, C18 5 µm koruyucu kolon • Ultrasonik karıştırıcı (Branson 3200, Almanya) • Vorteks (Heidolph, Almanya) • Santrifüjler – Soğutmalı santrifüj (Eppendorf 5420, Almanya) – Normal santrifüj (Labofuge 200, Thermo Scientific, İngiltere) • Milli-Q su arıtma cihazı (Elga, Almanya) • Millex-HV örnek süzme filtresi (sellüloz asetat 0.2 ve 0.45 µm) Yöntem • Sulu Mobil Faz Çözeltisi 1 – 1 gr amonyum asetat (CH3COONH4) tartılarak, 500 ml distile su ile karıştırılıp manyetik karıştırıcı sayesinde çözüldü. Daha sonra 1 ml % 0.1’lik formik asit ile çözelti 1000 ml ye tamamlandı. • Mobil Faz 2: – 1 lt Metanol +1 ml % 0.1 Formik Asit IS Tegafur • Kolşisin protonlandığında m/z 400.3→358.1 ve m/z 400.3→310.2 iki iyona dönüştüğünden bileşiği tanımlamak için bu değerler kullanıldı. • Tegafuru tanımlamak için ise m/z 200.8→130.9 değerleri kullanıldı. • Burada IS olarak tegafur seçilmiştir. Metod Değerler • Kütle spektrometrisi parametrelerini optimize etmek için, analit (kolşisin) ve internal standardın (tegafur) bir karışımla cihaza verilmesi sağlandı. • Optimizasyon parametreleri; curtain gaz, gaz 1 ve gaz 2 (nitrogen) sırasıyla; 15, 50 ve 30 birim, bekleme süresi; 200 ms; kaynağın sıcaklığı 550 0C; IonSpray voltage 4000 V. Declustering potential colchicine için 79 V ve tegafur için 45 V olarak uygulandı. Collision energy kolşisin molekülleri için 31 eV (m/z 400.3→358.1) ve 40 eV (m/z 400.3→310.2) ve Tegafur için 9 eV olarak uygulandı. • Bu optimizasyon değerleri defalarca yapılan işlemlerden sonra ortaya kondu ve diğer ölçümlerde standart olarak uygulandı. XIC of +MRM (3 pairs): 200.800/130.900 Da ID: tegafur from Sample 18 (colc (6.25 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray), Smoo... Max. 355.7 cps. 790 750 700 BULGULAR 650 600 550 I n t e n s it y , c p s 500 450 400 1166 350 300 250 200 100 50 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Time, min XIC of +MRM (3 pairs): 200.800/130.900 Da ID: tegafur from Sample 18 (colc (6.25 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray), Smoo... Max. 238.9 cps. 1155 239 230 220 210 200 190 180 170 160 150 I n t e n s it y , c p s 0 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Time, min XIC of +MRM (3 pairs): 400.200/358.100 Da ID: colc from Sample 18 (colc (6.25 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray), Smoothe... Max. 435.0 cps. 3106 435 420 400 380 360 340 320 300 280 I n t e n s it y , c p s • LC-MS/MS Kolşisin metodu ile yapılan kolşisin ölçümü 6.25 ng/mL’lik standart çözeltisinden elde edilen kromatogramlar.. 150 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Time, min 3.0 3.5 4.0 Doğruluk (Accuracy) • Bir yöntemin doğruluğu elde edilen değerin gerçek değere veya referans kabul edilmiş olan değere yakınlığının ölçüsüdür. • Kolşisin konsantrasyon düzeylerine göre yöntemin doğruluğunun değerlendirilmesi tablo 1de verildi. Tablo 1 Kolşisin konsantrasyonlarına göre yöntemin doğruluğunun değerlendirilmesi . Güniçi Tekrarlanabilirlik GÜN İÇİ TEKRARLANABİLİRLİK • Hazırlanan standart çözeltiler 20 ayrı eppendorf tüplerine aliquotlandı. • Çalışma günü bir aliquot çıkarıldı ve aynı gün içerisinde 20 kez ard arda ölçüldü. • Elde edilen sonuçlara göre ortalama, standart sapma (SD) ve varyasyon katsayısı (%CV) değerleri hesaplandı veTablo 2 de verildi. KOLŞISIN METODU Kolşisin (12.5 ng/mL) Tegafur 10 ng/mL) Ölçüm No alanlarının oranları 1. enjeksiyon 2. enjeksiyon 3. enjeksiyon 4. enjeksiyon 5. enjeksiyon 6. enjeksiyon 7. enjeksiyon 8. enjeksiyon 9. enjeksiyon 10. enjeksiyon 11. enjeksiyon 12. enjeksiyon 13. enjeksiyon 14. enjeksiyon 15. enjeksiyon 16. enjeksiyon 17. enjeksiyon 18. enjeksiyon 19. enjeksiyon 20. enjeksiyon Ortalama SD %CV 3,70 3,17 3,01 3,49 3,29 3,36 3,19 3,37 3,38 3,22 3,70 3,17 3,01 3,49 3,29 3,36 3,19 3,37 3,38 3,22 3,32 0,19 5,72 Tablo 2.Kolşisin metodu için gün içi tekrarlanabilirlik çalışması Günler Arası Tekrarlanabilirlik • Hazırlanan standart çözeltiler 20 ayrı eppendorf tüplerine aliquotlandı. • Her çalışma günü +4 oC’den çıkarılarak, 20 gün boyunca ölçüldü. • Sonuçlara göre ortalama, standart sapma (SD) ve varyasyon katsayısı (%CV) değerleri hesaplandı ve Tablo 3’de verildi. GÜNLER ARASI TEKRARLANABİLİRLİK Ölçüm No 1. gün 2. gün 3. gün 4. gün 5. gün 6. gün 7. gün 8. gün 9. gün 10. gün 11. gün 12. gün 13. gün 14. gün 15. gün 16. gün 17. gün 18. gün 19. gün 20. gün Ortalama SD % CV KOLŞISIN METODU Kolşisin (12.5 ng/mL) Tegafur 10 ng/mL) alanlarının oranları 3.70 3.28 2.49 3.50 3.62 2.57 3.40 3.09 2.71 2.94 3.19 3.37 3.22 2.75 2.89 2.79 3.51 3.49 3.00 2.79 3,12 0,38 12,1 Tablo 3.Kolşisin metodu için günlerarası tekrarlanabilirlik çalışması Linearite • Farklı konsantrasyonlarda hazırlanan standart çözeltiler ile yapılan linearite çalışmalarında, kolşisin standart konsantrasyonları ile elde edilen ölçüm sonuçlarının 50 ng/mL’ye kadar lineer olduğu saptandı. • Linearite çalışması sonucunda, pik alanları ile konsantrasyonlarının oldukça uyumlu olduğu gözlendi. Geri kazanım • • Çalışmamızda kolşisin ölçümünün yapılacağı plazma ile bu plazmaya, değişik konsantrasyonlarda kolşisin standartları eklenerek elde edilen örnekler ile 3’er defa ölçümler sonucunda geri kazanım oranları tespit edildi. Buna göre; 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 ng/mL bu konsantrasyonlarda verimlilik sırasıyla 0.96, 0.98, 0.96, 0.96, 0.97 şeklinde bulundu. Bu sayısal verilerin ışığında en yüksek geri kazanımın %98 ile 25 ng/mL konsantrasyonda olduğu gözlendi. GERİ KAZANIM Eklenen Konsantrasyon (ng/mL) 50 50 50 25 25 25 12,5 12,5 12,5 6,25 6,25 6,25 3,12 3,12 3,12 Ölçülen Kazanılan 48,7 47,6 49,1 23,7 24,6 23,9 12,3 11,8 12,03 6,2 6,1 6,08 3,08 2,94 2,98 0,97 0,95 0,98 0,95 0,98 0,96 0,98 0,94 0,96 0,99 0,98 0,97 0,99 0,94 0,96 Verim% 0,97 0,96 0,96 0,98 0,96 Tayin Limiti (Limit of Detection: LOD) • LOD için sinyal gürültü oranı (S/N: signal to noise) 3'ün üzerinde olmalıdır. • Denediğimiz en düşük konsantrasyon olan 0.01 ng/mL konsantrasyonunda S/N oranı 9.5 olarak bulunmuştur. • Bu nedenle yöntemimize ait LOD konsantrasyonu 0.01 ng/mL olarak kararlaştırıldı (Şekil 1). • Kromatogramda yumusatma (smoothing) yapıldığında S/N oranı artmakta yani kromatogram kalitesi de yükselmektedir. • Örneğin LOD için kromatogram yumuşatması yapıldığında S/N oranı 26.7 olmaktadır (Şekil 2). XIC of +MRM (3 pairs): 400.200/358.100 Da ID: colc from Sample 41 (colc (0.01 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray) Max. 100.0 cps. 3.46 100 95 90 S/N = 9.5 85 80 Peak Int.(Subt.)=9.5e+1 75 70 Ymax=1.0e+1 cps Ymin=0.0e+0 cps S/N = 9.5 I n t e n s it y , c p s 65 60 55 50 Peak Int.(Subt.)=9.5e+1 45 40 35 30 25 Ymax=1.0e+1 cps Ymin=0.0e+0 cps 20 15 !- Noise -! 10 5 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Time, min Şekil 1. LOD değerinin bulunması için elde edilen kromatogram XIC of +MRM (3 pairs): 400.200/358.100 Da ID: colc from Sample 41 (colc (0.01 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray), Smoothed... Max. 45.3 cps. 3.46 45 44 42 S/N = 26.7 40 38 36 Peak Int.(Subt.)=4.5e+1 34 32 Ymax=1.7e+0 cps Ymin=1.4e-10 cps I n t e n s it y , c p s 30 28 26 24 22 20 18 16 14 !- Noise -! 12 10 8 6 4 2 0 ! - Noise - ! 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time, min Şekil 2. Yumuşatılmış LOD değerinin bulunması için elde edilen kromatogram 4.0 Ölçüm Limiti (Limit of Quantitaion: LOQ) • LOQ için, sinyal gürültü oranı (S/N: signal to noise) 10‘ un üzerinde olmalıdır. • S/N oranı 0.01 ng/mL kolşisin konsantrasyonu için 9.5 olarak bulunduğundan bir üst konsantrasyona bakıldı. • 0.05 ng/mL konsantrasyondaki kolşisinin S/N oranı ise 16.5 olarak bulundu (Şekil 22). • Dolayısıyla LOQ değeri, 0.05 ng/mL kolşisin konsanstrasyonu olarak belirlendi. • Kromatogram yumuşatıldıktan sonra S/N oranı 53.7 olmuştur (Şekil 23). XIC of +MRM (3 pairs): 400.200/358.100 Da ID: colc from Sample 37 (colc (0.05 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray) Max. 170.0 cps. 170 160 S/N = 16.5 150 140 Peak Int.(Subt.)=1.7e+2 130 3.49 120 Ymax=1.0e+1 cps Ymin=0.0e+0 cps I n t e n s it y , c p s 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 -!Noise!- 10 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 S/N = 16.5 4.0 Time, min Şekil 22. LOQ değerinin bulunması için elde edilen kromatogram Peak Int.(Subt.)=1.7e+2 XIC of +MRM (3 pairs): 400.200/358.100 Da ID: colc from Sample 37 (colc (0.05 ppb)+teg(200ppb )) of Data20150602.wiff (Turbo Spray), Smoothe... cps Ymin=0.0e+0 cps Ymax=1.0e+1 3.47 110 105 100 S/N = 53.7 95 90 Peak Int.(Subt.)=1.1e+2 85 80 Ymax=2.0e+0 cps Ymin=7.4e-4 cps 75 I n t e n s it y , c p s 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 -!Noise!- 10 5 0 ! - Noise - ! 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time, min Şekil 23. Kromatogramda yumuşatılmış LOQ hesaplanması 4.0 Max. 110.0 cps. • Bu hesaplamalar sonrasında yöntemin tekrarlanabilirliğin kabul edilebilir olup olmadığının belirlenmesinde, NCCLS EP5 protokolünde belirtilen kriterlerden yararlanıldı. • Günde tek çalışma ile yapılan hesaplamalarda, NCCLS EP15 protokolünde gösterilen çalışma iş akışı ve formüller kullanıldı. • LOD VE LOQ hesaplamaları esnasında NCCLS EP15 protokolünde gösterilen çalışma iş akışı ve formüller kullanıldı. • Doğruluğun hesaplanması esnasında ise NCCLS EP 9 ve EP15 protokolünde gösterilen çalışma iş akışı ve formüller kullanıldı. • Sonuç olarak, plazma kolşisin ölçümünde laboratuvarımızda kullanacağımız yeni geliştirdiğimiz LC-MS/MS metodu ile daha kısa zamanda analiz imkânı tanıması, mobil faz hazırlama kolaylığı, maliyet düşüklüğü, daha iyi kromatogramların ve daha doğru sonuçların elde edilmesinin sağlanması gibi nedenlerden tercih sebebi olacağı düşünülmektedir. • Laboratuvarımızda kurduğumuz LC-MS/MS yöntemi ile kolşisin ölçümü, Türkiye’deki ilk kolşisin ölçümü olma özelliği de taşımaktadır. • Yapılacak daha ileri çalışmalar ile daha standardize LC-MS/MS yöntemleri için bir ön çalışma niteliği de taşımaktadır. Teşekkürler…