+ + M.tuberculosis
Transkript
+ + M.tuberculosis
TÜBERKÜLOZ TANI VE TAKİBİNDE MİKROBİYOLOJİ LABORATUARLARININ YERİ,SORUMLULUĞU, BİRLİKTE NELER YAPILABİLİR Uzm Dr.Banu BAYRAKTAR Dünyada en sık ölüme neden olan infeksiyonlardan biri Dünya nüfusunun 1/3’ü infekte Her yıl dünya nüfusunun %1’ i infekte 2 milyon ölüm/yıl Dünyada Tüberküloz SAPTANAN Tüm vakalar 4081754 Yayma (+) 1716333 İnsidans 66/100000 TAHMİN EDİLEN Tüm vakalar 8797000 Yayma (+) 3887000 İnsidans 141/100000 Ülkemizde Tüberküloz 2004* Tüm vakalar İnsidans Yayma (+) TB 19 944 28/100000 5870 *WHO Report 2004 .Global Tuberculosis Control Tuberculosis (as of 22 March 2006) -> Estimated TB -> Estimated TB incidence --> TB incidence, all forms (per 100 000 population per year), Türkiye’de yıllara göre tüberküloz insidansı (n/100 000) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Türkiye 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 82 87 56 60 56 61 60 58 52 49 44 44 44 37 32 40 39 34 27 25 WHO Report 2004. Global Tuberculosis Control 2004 26 TÜBERKÜLOZ LABORATUVARLARI TB yayılımını önlemede ve kontrol altına alabilmede Örnekte M.tuberculosis tespiti İzolasyon İdentifikasyon Anti-tüberküloz ilaç duyarlılığı testleri ile katkı sağlar. Tüberküloz Laboratuar Seviyeleri CDC, Amerikan Toraks Derneği ve CAP tüberküloz laboratuarlarını iş yükü,tecrübe ve maliyet-yarar ilişkisine bağlı olarak basamaklandırmışlardır. Düzen Tüberküloz laboratuarı bu sınıflamay göre III. Seviyede hizmet veren bir laboratuardır. SEVİYE ARB boyama Kültür M.tuberculosis kompleks identifikasyonu Bütün mikobakterilerin identifikasyonu İlaç duyarlılığı I II III + - + + + + + + + + + Tüberküloz laboratuarında yapılan testler ARB boyama Kültür İdentifikasyon tetsleri Moleküler yöntemlerle örnekte direkt Mycobacterium tuberculosis complex saptanması Antimikobakteriyal duyarlılık testleri ARB boyama Mikobakteriler için başlıca iki boyama tekniği kullanılmaktadır. Karbolfuksin boyama -Ziehl-Neelsen -Kinyoun ( soğuk boyama) Florokrom boyama -auramine O, -auramine-rhodamine Florokrom boyama ile saptanan pozitifliklerin Z-N ile doğrulanması gerekmektedir. ARB boyama Kültürle karşılaştırıldığında ARB boyamanın duyarlılığı %22 - 78 olduğu bildirilmiştir. &Aynı gün sonuç alınmakta &Pozitif saptanabilmesi için örnekte 5000-10000 basil/ml bulunması gerekir. ARB boyama Görülen ARB miktarı SONUÇ Karbolfuksin boya 1000 X Florokrom boya 250 X 450 X Negatif 0 0 0 Şüpheli, tekrar 1-2/300 alan 1-2/30 alan 1-2/70 alan 1+ 1-9/100 alan 1-9/10 alan 2-18/50 alan 2+ 1-9/10 alan 1-9/1 alan 4-36/10 alan 3+ 1-9/1 alan 10-90/1 alan 4-36/1 alan 4+ >9/1 alan >90/1 alan >36/1 alan KÜLTÜR Normal flora içeren klinik örnekler ile alınmaları ve transport işlemleri sırasında sterilizasyon kurallarına uyulmadığı düşünülen klinik örneklere; organik kalıntıları sindirmek (digestion), kontaminasyona neden olan bakteri ve mantarları elimine etmek amacıyla dekontaminasyon işlemi uygulanır. -NALC-NaOH yöntemi -NaOH yöntemi -Zephiran-trisodium phosphate yöntemi -Oxalic asit yöntemi -Cetylpyridinium chloride-sodium chloride yöntemi -Sülfirik asit yöntemi KÜLTÜR 101-102 canlı basil/ml saptayabildiğinden yaymalara göre daha duyarlıdır. Kültür için katı besiyerleri ve sıvı besiyerleri kullanılmaktadır. Sıvı besiyerlerinde basilin üreme süresi daha kısadır. Bakteri veya mantar kontaminasyonunun önüne geçilebilmesi amacıyla antimikrobiyallerin katıldığı selektif besiyerleri de mevcuttur. KÜLTÜR Katı Besiyerleri: Yumurta temelli ve agar temelli besiyerleri mevcuttur. Nonselektif Besiyerleri -Löwenstein-Jensen (L-J) -Petragnani -American Thoracic Society -Middlebrook 7H10 -Middlebrook 7H11 Selektif Besiyerleri - L-J Gruft (penisilin,nalidiksik asit) - Mycobactosel L-J (siklohekzimid, linkomisin, nalidiksik asit) - Mycobactosel Middlebrook 7H10 - Mitchison’s selektif 7H11 (karbenisilin,polimiksin B,trimetoprim laktat, amfoterisin B) KÜLTÜR Bifazik besiyerleri: Septi-Check (BD Biosciences) Sıvı besiyeri (Middlebrook 7H9) Üç tip katı besiyeri (L-J, Middlebrook 7H11, çukulatamsı agar) Kan dışındaki tüm klinik örnekler için uygun Duyarlılığı BACTEC 460 TB ye benzer ancak üremeyi saptama zamanı daha uzundur. KÜLTÜR Sıvı besiyerleri: MGIT (BD, Biosciences) MB Redox (Heipha Diagnostica Biotest) * Düşük kapasite ile çalışan laboratuvarlarda tercih edilir. KÜLTÜR Tam otomatize sistemler (Sıvı besiyerleri): BACTEC 460 (BD Biosciences) Bactec Mycobacterium Growth Indicator Tube (MGIT) 960 (BD Biosciences) Bactec 9000 MB (BD Biosciences) ESP II (Trek Diagnostics) MB/BacT ALERT 3D (BioMerieux) KÜLTÜR BACTEC 460 TB Yarı otomatize, radyometrik BACTEC 12B besiyeri 14C işaretli palmitik asit içerir 14C işaretli palmitik asit kullanımı ↓ 14CO 2 ↓ Üreme İndeksi (GI) KÜLTÜR BACTEC 460 TB Duyarlılık Özgüllük PPD NPD & % % % % 83.3- 89.3 99.2-100 100 96.4-99.2 Ortalama sonuç alma süresi 4-15 gün NTM <7 gün J Clin Microbiol 1999 Jan; 37(1): 229 – 32 KÜLTÜR MGIT 960 Tam otomatize, radyometrik olmayan MGIT tüpünün dibindeki silikon içine floresan madde gömülüdür. Floresan madde sıvı besiyerindeki oksijen varlığına duyarlıdır. Üreyen mikobakterilerce oksijenin kullanılması sonucu floresans oluşumu KÜLTÜR Tam otomatize sistemler : Sistemler arasında izolasyon oranı açısından önemli bir fark yok. Mikobakterileri üretme süreleri, radyometrik BACTEC 460 TB ile hemen hemen aynıdır. Kontaminasyon oranları açısından sistemler arasında önemli bir fark yok ancak, bu sistemlerde oran BACTEC 460 TB ve katı besiyerlerine göre daha yüksek CDC → Sıvı + katı besiyeri kombinasyonu Mikobakterilerin izolasyon şansını arttırıyor. 2006 Yılı Düzen Laboratuvarı BACTEC Kültür ve ARB Verileri ARB POZİTİF BACTEC NEGATİF TOPLAM POZİTİF 55 65 120 NEGATİF 1 992 993 TOPLAM 56 1057 1113 İdentifikasyon Yöntemleri Konvansiyonel biokimyasal yöntemler NAP (p-nitro-a- acetylamine-b- hydroxyprophonone) (BACTEC) Moleküler yöntemler AcuProbe DNA hibridizasyon PCR-RFLP INNO-LiPA DNA sekanslama İdentifikasyon yöntemleri Konvansiyonel biokimyasal yöntemler Üreme hızı, üreme ısısı TCH (Thiophene-2- Pigment üretimi Koloni ve mikrokoloni görünümü, kord faktör oluşumu Niasin testi Nitrat redüksiyonu testi Katalaz testi PNB (para-nitro benzoik asit) içeren besiyerinde üreme carboxylic acid hydrazide) ile üremenin inhibe edilmesi Pirazinamidaz testi Tween 80 hidrolizi testi Arilsülfataz testi Tellurit redüksiyonu Üreaz testi İdentifikasyon yöntemleri Kord oluşumu Duyarlılık >%90 İdentifikasyon yöntemleri Niasin birikimi; Niasin NAD’a dönüşemeyip besiyerinde birikir M. tuberculosis M. simiae niasin (+) M. chelonae M. bovis’in bazı suşları LJ’de, 3 haftalık kültürler ile çalışılmalıdır Kullanılan ayıraçlar toksiktir İdentifikasyon yöntemleri Nitrat redüksiyonu Nitroredüktaz enzimi ile nitratların nitritlere indirgenmesi M. tuberculosis M. kansasii M. szulgai nitroredüktaz üretir Asitli ortama amin eklendiğinde kırmızı diazonium boyası oluşur İdentifikasyon yöntemleri Katalaz aktivitesi INH dirençli M. tuberculosis M. bovis dışında bütün mikobakteriler katalaz (+). Semikantitatif katalaz testi Isıya stabil katalaz testi M. tuberculosis kompleks; Katalaz aktivitesi düşük ve ısıya stabil değil İdentifikasyon yöntemleri TCH varlığında üreyebilme Niasin (+) M. bovis’i M. tuberculosis’den ayırır. M. bovis TCH’a duyarlıdır Kontrole göre >%1 üreme varsa; TCH dirençli Besiyeri karanlıkta saklanmalıdır İdentifikasyon yöntemleri M.tbc Üreme sıcaklığı Pigmentasyonu Niasin TCH üreme Nitrat indirgenmesi Semikantitatif katalaz 68 C katalaz Tween hidrolizi Tellurit indirgenmesi %5 NaCl tolerans Arilsülfataz (3gün) Üreaz Pirazinamidaz(4gün) M.africanum 37 C 37C Nonkromojen(100) N + (95) V + V + V < 45 mm (89) < 45 mm ± (68) ± (36) ± (64) + + - M.bovis 37C N(100) -(4) -(9) < 45 mm (69) -(21) -(0) -(0) ± (50) - İdentifikasyon yöntemleri NAP ile inhibisyon-BACTEC Duyarlılık>%95 M. kansasii, M. gastri, M. terrae kısmen inhibe olabilir 4 günden önce değerlendirilmemeli Biyokimyasal testler veya moleküler yöntemlerle desteklenmeli İdentifikasyon yöntemleri İdentifikasyon yöntemleri PCR-RFLP Hsp 65 geni PCR ile çoğaltıldıktan sonra, BstE II ve Hae III enzimleriyle kesilip poliakrilamid jelde yürütüldüğü bir yöntem En az 32 Mikobakteri türünü birbirinden ayırabiliyor. M.tbc complex içinde tür ayrımı yapamıyor. Moleküler yöntemler Tüberküloz tanısında kullanılan moleküler testler, hızlı ve özgüllükleri yüksek olmakla birlikte duyarlılıkları kültürden düşüktür. Kültürde üreyen mikroorganizmaların sulandırılması ile yapılan çalışmalarda saptama sınırı 5-100 CFU arasında değişirken, gerçek klinik örneklerde duyarlılıklar çok daha düşük bulunmaktadır. Moleküler yöntemler Klinik örneklerde tüberkülozun saptanmasında geleneksel ‘in-house’ PCR yönteminin geçerliliği ve tekrarlanabilirliğinin belirlenmesi amacıyla yapılan bir çalışmada, basil miktarı standardize edilmiş örnekler aynı hedef bölgenin çoğaltıldığı yedi laboratuarda test edilmiştir. Bu çalışmada, duyarlılık ve özgüllüklerin %290, yalancı pozitifliklerin ise %3-77 oranında değiştiği saptanmıştır. Günümüzde klinik örnekte M.tuberculosis saptanmasında standardize moleküler testler tercih edilmektedir. Moleküler yöntemler Amplicor MTB test (Roche Diagnostics) AMTD (Gen-Probe) testi SDA (BD ProbeTec ET) LCx MTB (Abbott) Real-time PCR Inno-LiPA Rif.TB (Innogenetics) Moleküler yöntemler Amplicor MTB test (Roche Diagnostics) ¾ İlk ticari kit ¾ Yayma pozitif solunum yolu örneklerinde kullanılmak üzere FDA onaylı ¾ 16S rRNA ¾ Cobas Amplicor MTB, bu testin otomotize versiyonudur. ¾ Test süresi yaklaşık 4 - 4.5 saat Moleküler yöntemler AMTD (Gen-Probe) ¾ FDA onaylı ilk amplifikasyon testidir. ¾ RNA temelli ve izotermal bir çoğaltma yöntemidir. ¾ TMA (transcription mediated amplification) ¾ Test süresi yaklaşık 3.5 saat Düzen Laboratuarı 2001-2007 AMTD Sonuçları AMTD POZİTİF NEGATİF TOPLAM 27 8 35 NEGATİF 18 979 997 TOPLAM 45 987 1032 BACTEC POZİTİF ¾ARB(+), AMTD(+) hasta sayısı:4 ¾ARB(-), AMTD(-) hasta sayıs:41 Moleküler yöntemler SDA (Strand Displacement Amplification) (BD ProbeTec ET) ¾ DNA polimeraz ve restriksiyon enzimlerinin birlikte yer aldığı izotermal bir yöntemdir. ¾ M.tuberculosis komplekse özgül IS6110 ve tüm mikobakterilerde bulunan 16S rRNA hedef dizileri birlikte çoğaltıldığından M.tuberculosis tür tayini yapabilmektedir. ¾ Toplam test süresi yaklaşık 3 saat Moleküler yöntemler LCx MTB (Abbott) ¾ Prob molekülünün çoğaltıldığı ligaz zincir reaksiyonu (LCR) yöntemi kullanılmaktadır. ¾ Çoğaltma termal cycler da yapılmaktadır. ¾ Test süresi yaklaşık 5 saat Moleküler yöntemler Real-time PCR ¾ Çoğaltma ile birlikte ve eş zamanlı olarak gerçekleşen saptama, DNA ya bağlanan boyalar veya floresan veren boyalar ve işaretli problar ile sağlanmaktadır. ¾ Yöntemin avantajları, PCR sonrası ürün saptama basamaklarının olmaması, kısa sürede sonuçlanması, kantitasyon yapılabilmesi ve kontaminasyon riskinin çok düşük olmasıdır. Moleküler yöntemler Inno-LiPA Rif.TB (Innogenetics) ¾ Hibridizasyon yöntemidir. ¾ Klinik örneklerde M.tuberculosis kompleks ve rifampisin direnci birlikte saptanabilmektedir. Moleküler Tanı Sistemlerinin Performansı (Solunum Örnekleri) TİCARİ SİSTEMLER DUYARLILIK % ÖZGÜLLÜK % PPD % NPD % MTD 88.0 - 91.2 99.1 - 100 93.9 - 98.6 91.7 - 99.4 COBAS AMPLICOR 78.3 - 96.1 99.7 - 100 90.9 - 100 97.5 - 99.8 LCx 85 - 100 99.3 - 100 98.7 - 100 98 - 100 SDA (BD Probe Tec ET) 87.5 - 92.7 96.0 - 99.0 70.0 - 97.0 96.0 - 99.7 Moleküler yöntemler Moleküler testlerin klinik örnekte tüberküloz varlığının saptanmasında, ARB mikroskopisi ve kültür ile birlikte uygulanması önerilmektedir. Amplikor ve AMTD testleri, M.tuberculosis ile tüberküloz dışı mikobakteri ayrımının yapılabildiği merkezlerde, son bir yıl içinde tedavi almayan hastaların solunum yolu örneklerinde kültür ile birlikte yapılması koşulu ile FDA onayı almıştır. CDC Morb Mortal Wkly Rep:2000;49:593-4 Moleküler yöntemler Laboratuvar tanıda moleküler ticari sistemler; TB şüpheli hastaların,özellikle yayma (+) solunum örneklerinde Hastalığın eradikasyonu için mücadelede, Tedavinin takibi ve yönlendirilmesinde, etkili görünmektedir. Mevcut ticari ürünler asla tarama amaçlı kullanılmamalı, Referans laboratuvarlarda kurulmasına önem verilmeli, Konvansiyonel yöntemlerin altın standart olduğu unutulmamalı Duyarlılık Testleri CDC Her hasta için kültürde izole edilen ilk M.tuberculosis izolatına duyarlılık testi Üç aylık tedaviden sonra, kültür pozitifliği devam eden veya klinik yanıtsızlığı olan her hastada testin tekrarı Duyarlılık Testleri CLSI’a göre Primer İlaçlar İzoniazid Rifampisin Etambutol Pirazinamid Ülkemizde Primer İlaçlar Sekonder ilaçlar Streptomisin Kapreomisin Etionamid Kanamisin Ofloksasin Rifabutin İzoniazid Rifampisin Etambutol Streptomisin Duyarlılık Testleri Agar Proporsiyon Yöntemi: Referans yöntemdir. 10-2, 10-4 dilüsyonlu inokulumlar kullanılır. 10-2 10-4 Duyarlılık Testleri İlaçlı b.y. de üreyen koloni sayısı İlaçsız b.y. de üreyen koloni sayısı ≥ %1 (KP) Î R Duyarlılık Testleri Proposiyon yöntemi Direkt test Dekontamine ve konsantre edilmiş ARB pozitif örnek kullanılır. İndirekt test Primer kültürde üremiş saf bakteri kolonileri kullanılır. Duyarlılık Testleri CDC; örnek kabul edildikten sonra 30 gün içinde primer ilaçlara karşı duyarlılık sonuçları bildirilmelidir. Bu amaçla CLSI; FDA’in de onayladığı bazı hızlı, sıvı besiyerinde kültüre dayalı ticari sistemlerin kullanılabileceğini kabul etmiştir. BACTEC 460 TB, MGIT 960, ESP II Duyarlılık Testleri Duyarlılık Test Sonuçları Geciktirilmeden bildirilmelidir. Her bir ilacın adı ve sonucun yorumu mutlaka belirtilmelidir. CLSI alt komitesi; kullanılan yöntem ve besiyeri; kullanılan konsantrasyonlar ve referans yönteme eşdeğer karşılıkları, direnç oranının belirtilmesini önermektedir. Düzen laboratuarı, 1994-2006 yıllarına ait majör ilaç direnç yüzde verileri Major Duyarlılık Testi Sonuçları 70 60 % 50 40 30 20 10 0 1 2 3 4 5 6 7 YILLAR 8 9 10 11 12 Hepsi duyarlı 5 ilaca R 1 ilaca R 2 ilaca R 3 ilaca R 4 ilaca R Birlikte neler yapabiliriz? Tüberküloz şüpheli bir vakada EZN ve kültür çalışmasını mutlaka birlikte yapılmasını sağlamalıyız. (idealinde 3 örnekte) Her hastadan izole edilen ilk M.tuberculosis suşunun mutlak majör ilaçlara direncine bakmalıyız. Tedavinin üçüncü ayında hala kültür pozitifliği süren hastalarda direnç gelişiminden şüphelenmeli, duyarlılık tetsini tekrarlamalı ve minör ilaç dirençlerine bakmalıyız. Hızlı tanı için moleküler testleri kullanmalı, ancak yanında altın standart kültür tetslerini mutlaka istemeliyiz.