RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
Transkript
RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0
altona altona DIAGNOSTICS DIAGNOSTICS RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 08/2014 altona Diagnostics GmbH Mörkenstr. 12 22767 Hamburg Almanya phone fax e-mail +49 40 548 06 76 - 0 +49 40 548 06 76 - 10 info@altona-diagnostics.com www.altona-diagnostics.com always a drop ahead. RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 aşağıda sıralanan cihazlarla kullanılmak üzere hazırlanmıştır: Mx 3005P™ QPCR System (Stratagene) VERSANT® kPCR Molecular System AD (Siemens) ABI Prism® 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) LightCycler® 480 Instrument II (Roche) Rotor-Gene® 3000/6000 (Corbett Research) Rotor-Gene® Q5/6 plex Platform (QIAGEN) CFX96™ system/Dx real-time system (BIO-RAD) in vitro diagnostik kullanım amaçlı Ürün No.: 441013 96 rxns MAN-441010-TR-01 Store at -25°C ... -15°C Ağustos 2014 altona Diagnostics GmbH • Mörkenstraße 12 • D-22767 Hamburg RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 İçindekiler 1. KullanımAmacı .....................................................................................6 2. KitBileşenleri ........................................................................................6 3. MuhafazaEtme ......................................................................................6 4. GerekliOlanamaÜrünleTeslimEdilmeyenMalzemeler Ve Cihazlar SınırlamalarveÖnlemler ....................................................................32 13. Kalite Kontrol 14. TeknikYardım ......................................................................................33 15. TicariMarkalarveRetBeyanları .......................................................33 16. SembollerinAçıklaması ......................................................................34 ......................................................................................33 .............................................................................................7 5. TemelBilgiler .........................................................................................8 6. ÜrünTanımı ......................................................................................... 11 7. UyarılarveÖnlemler ...........................................................................13 8. KullanmaTalimatı ...............................................................................14 8.1 Örnek Hazırlama 8.2 Master Mix Hazırlanışı ..........................................................................15 8.3 Reaksiyon Hazırlanışı ...........................................................................17 9. GerçekZamanlıPCRAletleriniProgramlama ..................................18 9.1 Ayarlar 9.2 Floresan Detektörleri (Boyalar) 9.3 Sıcaklık Profili ve Boya Alma ...................................................................................14 ...................................................................................................18 .............................................................18 ................................................................19 10. VeriAnalizi ...........................................................................................19 10.1 Diagnostik Test Çalışmalarının Geçerliliği 10.1.1 Geçerli Diagnostik Test Çalışması 10.1.2 Geçersiz Diagnostik Test Çalışması ............................................20 ........................................................20 .....................................................20 10.2 Sonuçların Yorumlanması 11. PerformansDeğerlendirmesi .............................................................22 11.1 Analitik Hassasiyet 11.2 Analitik Özgüllük 11.3 Kesinlik 4 12. .....................................................................21 ................................................................................22 ...................................................................................25 ..................................................................................................28 5 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 1. KullanımAmacı 4. erekliOlanamaÜrünleTeslimEdilmeyenMalzemeler G Ve Cihazlar RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 Ebola ve Marburg virüsüne spesifik RNA'nın kalitatif saptanması ve diferansiyasyonu için gerçek zamanlı PCR tekno- • Uygun real time (gerçek zamanlı) PCR aleti (Bölüm 6: Ürün Tanımı) lojisi temelinde in vitro bir diagnostik testtir. • Uygun nükleik asit ekstraksiyon sistemi veya kiti • 2 ml reaksiyon tüpleri için rotorlu masaüstü santrifüjü • 96 kuyulu reaksiyon plakaları kullanılıyorsa mikrotitre plakaları için rotorlu 2. KitBileşenleri Kapak Rengi Mavi Bileşen Master A Şişe Sayısı Hacim [µl/Şişe] Mor Master B santrifüj Yeşil Kırmızı Turuncu Dahili Pozitif Kontrol Pozitif Kontrol Kontrol Hedefi Ebola Hedefi Marburg Beyaz • Vorteks karıştırıcı • Karşılık gelen (optik) kapatma materyalli 96 kuyulu uygun reaksiyon tüplüğü PCR derecesinde Su 8 8 1 1 1 1 60 180 1000 250 250 500 veya reaksiyon tüpleri • Pipetler (ayarlanabilir) • Filtreli pipet uçları (tek kullanımlık) • Pudrasız eldivenler (tek kullanımlık) NOT 3. MuhafazaEtme Lütfenaletlerinüreticinintalimatveönerilerinegörekurulduğundan, kalibre ve kontrol edildiğinden ve bakımının yapıldığından emin • RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 kuru buzla sevk edilir. Kit bileşen- olunuz. lerinin donmuş bir şekilde teslim edilmesi gerekir. Kitler teslim alındığında, bir veya birkaç bileşen donmuş durumda değilse veya tüpler sevkiyat sırasında zarar görmüş ise, yardım için altona Diagnostics GmbH ile irtibat kurun. • Tüm bileşenler teslim alındıktan sonra (must-have) -25 °C ... -15 °C'de saklanmalıdır. • Master reaktiflerin tekrarlı bir şekilde çözülüp dondurulmasından (iki kezden fazla) kaçınılmalıdır. Bu durum analiz performansını etkileyebilir. Reaktifler ara sıra kullanılacaklarsa bölüntüler halinde dondurulmalıdır. 6 • +4°C'de saklama iki saatlik bir süreyi geçmemelidir. • Master A ve Master B ışıktan korunmalıdır. 7 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 5. TemelBilgiler RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 reaksiyonunda Ebola ve Marburg virüsünü saptayıp sınıflandırabilmiştir. 2007 yılında Panning ve onun meslektaşları tarafından hazırlanan ve L genini hedef alan Ebola ve Marburgvirüs, Filoviridae ailesi içinde yer alır. Marburgvirus türü Marburg protokol L geni analizinin ne kadar duyarlı ve spesifik bir tahlil olduğunu göstermiştir. marburgvirus (MARV) adlı tek bir tür içerir. Ebolavirus türü beş sınıfa ayrılır: [10]. O zamandan beri bu tahlil filovirüse tanı koymak için dünya çapında birkaç Bundibugyo ebolavirus (BEBOV), Reston ebolavirus (RESTV), Sudan ebolavirus referans laboratuvarı tarafından kullanılmıştır. Yine de mevcut son sekans bilgiler (SEBOV), Tai Forest ebolavirus (TAFV) ve Zaire ebolavirus (ZEBOV) [1]. ve yeni Ebola türlerinin (BEBOV) ortaya çıkması mevcut yöntemleri sürekli olarak kontrol edip güncelleme gereğini ortaya koymuştur. 2007 L geni analizinin bazı zayıf Güneydoğu Asya'da endemik RESTV hariç tüm bilinen Ebola ve Marburg virüs türleri yönleri vardır ve bu nedenle altona Diagnostics GmbH tarafından filovirüslerin L Afrika'da yaygındır. Filovirüslerin doğal kaynakları meyve yarasalarıdır [2] [3]. geni temelinde yeni bir analiz geliştirilmiştir. İnsanlara geçtikten sonra filovirüsler %20-90 şeklinde yüksek mortalite oranına sahip şiddetli bir hemorajik ateşe neden olabilir (tekli vakalarda türe ve bakterinin kaynağına Viral polimerazı kodlayan filovirüs L geni yüksek ölçüde korunmuş sekans unsurları bağlı olarak) [4]. Bulaşma şeklini belirlemek genellikle zordur. Enfekte vahşi hayvanları içerir. Enzimatik olarak aktif yerleri kodlayan bölgelerdeki mutasyonlar genellikle avlama, kesme ve tüketme virüsün insan popülasyonuna girmesinin olası işlev kaybıyla sonuçlanır. Bu mutantlar, viral tür benzerleri arasından kaybolur ve yollarındandır. Yarasalarla doğrudan temasın da olası bir enfeksiyon yolu olduğu RT-PCR tabanlı analizin özgüllüğü üzerine negatif bir etki yapmazlar. Bu nedenle gösterilmiştir [5]. Birçok memeli türü filovirüs enfeksiyonlarına duyarlıdır. Özellikle RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 için hedef sekans olarak L genini şempanzeler ve goriller Ebolavirus epidemilerinden önemli ölçüde etkilenen kategoriye kullanmaya karar verdik. Diagnostik RT-PCR'larda RNA virüslerinin L genini seçme aittirler. Sonuç olarak bu büyük maymun popülasyonlarında belirgin bir azalma işlemi geçmişte Lassa virüsü, filovirüsler ve diğer RNA virüsleri için de başarıyla olmuştur [6]. sonuçlanmışır [10–12]. Semptomlar hastalık başlangıcında pek belirgin değildir ve genellikle halsizlik, ateş ve vücudun çeşitli kısımlarında ağrı şeklinde ortaya çıkar. [7]. Salgın başlangıcında RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 bir birinci basamak diagnostik test olarak hastalık genellikle Afrikanın güney Sahra bölgesinde sık görülen Malarya, Tifo veya önerilir. Bu test ilgili filovirüs türlerini saptamak üzere tasarlanmıştır. altona Diagnostics diğer ateşli hastalıklarla karıştırılır. GmbH ikinci basamak bir analiz de sunmaktadır. RealStar® Filovirus Type RT-PCR Kit 1.0 virüs genomundaki diğer sekansları hedefler ve böylece doğrulayıcı bir Akut hastalık sırasında enfeksiyöz virüs titresi ve RNA titresi genellikle yüksektir ve viremi diagnostik sonuç oluşturma olasılığını sunar. RealStar® Filovirus Type RT-PCR Kit 1.0 seviyesi hastalığın sonucuyla negatif korelasyon gösterir [8]. Kanama ve diğer kan ayrıca tüm ilgili filovirüslerin türlerine kadar ayırt edilmesini mümkün kılar. kaybetme türleri de Ebola ve Marburg ateşinde ölümcül sonuç göstergelerindendir [7]. Laboratuvar yoluyla tanı koyma tercihen plazma, serum ve hatta tüm kan örneklerinde Filovirüs enfeksiyonlarından şüphelenilmesi ve bunların doğrulanmasının toplum RT-PCR kullanımı yoluyla yapılır. Serolojik testler destekleyici diagnostik araçlar sağlığı ve vaka yönetimi üzerine büyük etkisi vardır. Tüm vakaların kamu sağlığı ve olarak faydalıdır ama hastalığın primer tanısı için faydalı değildir. Hatta birçok biyogüvenlikten sorumlu ilgili makamlara hemen bildirilmesi gerekir (Almanya hastada (özellikle ölümle sonuçlananlarda) hastalık sırasında saptanabilir antikor içinde: Robert Koch Institut, Berlin; ve yerel “Landesgesundheitsämter -Ülke Sağlık titresinin hiç oluşmadığı saptanmıştır. [9]. Merkezlerine-”). Diagnostik işlem (örn. önerilen ayırıcı tanı, olası A ve B örneği kullanımı) uzman referans kurumlarıyla tartışılmalıdır. Filovirüs tespiti için birçok gerçek zamanlı RT-PCR protokolü yayımlanmıştır, ama bunların hiçbirisi ne bir dahili amplifikasyon kontrolü içermiş ne de bir RT-PCR 8 9 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 [1] Carroll SA, Towner JS, Sealy TK, McMullan LK, Khristova ML, Burt FJ, et al. [12] Vieth S, Drosten C, Lenz O, Vincent M, Omilabu S, Hass M, et al. RT-PCR assay Molecular Evolution of Viruses of the Family Filoviridae Based on 97 Whole-Genome for detection of Lassa virus and related Old World arenaviruses targeting the L gene. Trans Sequences. J Virol 2013;87:2608–16. R Soc Trop Med Hyg 2007;101:1253–64. [2] NOT Towner JS, Amman BR, Sealy TK, Carroll SAR, Comer JA, Kemp A, et al. Isolation of Genetically Diverse Marburg Viruses from Egyptian Fruit Bats. PLoS Pathog Filovirüslerinmolekülerevriminedeniylezamaniçindemutasyon- 2009;5:e1000536. [3] ların birikiminin herhangi bir PCR temelli test sisteminde yalancı Leroy EM, Epelboin A, Mondonge V, Pourrut X, Gonzalez J-P, Muyembe-Tamfum negatif sonuçlara neden olması şeklinde bir risk, sistemin doğası J-J, et al. Human Ebola Outbreak Resulting from Direct Exposure to Fruit Bats in Luebo, gereğimevcuttur. Democratic Republic of Congo, 2007. Vector-Borne Zoonotic Dis 2009;9:723–8. [4] Kortepeter MG, Bausch DG, Bray M. Basic Clinical and Laboratory Features of Filoviral Hemorrhagic Fever. J Infect Dis 2011;204:S810–S816. [5] Van Paassen J, Bauer MP, Arbous MS, Visser LG, Schmidt-Chanasit J, Schilling 6. ÜrünTanımı S, et al. Acute liver failure, multiorgan failure, cerebral oedema, and activation of proangiogenic and antiangiogenic factors in a case of Marburg haemorrhagic fever. Lancet Infect Dis RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0, filovirüse spesifik RNA'nın kalitatif 2012;12:635–42. olarak saptanması için gerçek zamanlı PCR teknolojisini temel alan bir in vitro [6] diagnostik test sistemidir. Leroy EM, Rouquet P, Formenty P, Souquière S, Kilbourne A, Froment J-M, et al. Multiple Ebola virus transmission events and rapid decline of central African wildlife. Science Analiz, ilgili insan patojenleri olan tüm filovirüs türleri ve Restonvirüsü saptamak 2004;303:387–90. üzere tasarlanmıştır. Reaktif sistemi, olası RT-PCR inhibisyonunu tanımlamak ve [7] reaktifler veya kitin bütünlüğünü doğrulamak üzere bir heterolog amplifikasyon Roddy P, Howard N, Van Kerkhove MD, Lutwama J, Wamala J, Yoti Z, et al. Clinical Manifestations and Case Management of Ebola Haemorrhagic Fever Caused by a Newly sistemi (Dahili Kontrol) içerir. Identified Virus Strain, Bundibugyo, Uganda, 2007–2008. PLoS ONE 2012;7:e52986. Towner JS, Rollin PE, Bausch DG, Sanchez A, Crary SM, Vincent M, et al. Rapid Test, gerçek zamanlı RT-PCR teknolojisini temel alır ve RNA'yı tamamlayıcı DNA'ya Diagnosis of Ebola Hemorrhagic Fever by Reverse Transcription-PCR in an Outbreak Setting (cDNA) dönüştürmek için revers transkriptaz (RT) reaksiyonu, spesifik hedef and Assessment of Patient Viral Load as a Predictor of Outcome. J Virol 2004;78:4330–41. sekansların amplifikasyonu için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve amplifiye [9] edilmiş DNA'nın saptanması için hedefe spesifik problar kullanır. Problar, floresan [8] Gupta M, MacNeil A, Reed ZD, Rollin PE, Spiropoulou CF. Serology and cytokine profiles in patients infected with the newly discovered Bundibugyo ebolavirus. Virology raportör ve söndürücü boyalarla etiketlenmiştir. 2012;423:119–24. Ebolavirus RNA için spesifik problar FAM floroforu ile etiketlenmiştir. Marburgvirus [10] RNA için spesifik problar Cy5 ile aynı özelliklere sahip bir floroforla etiketlenmiştir. Panning M, Laue T, Ölschlager S, Eickmann M, Becker S, Raith S, et al. Diagnostic Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Kit for Filoviruses Based on Dahili Kontrol (IC) hedefi için spesifik prob, JOE floroforu ile etiketlenmiştir. Ayırt the Strain Collections of all European Biosafety Level 4 Laboratories. edilebilir boyalarla bağlantılı problar kullanılması gerçek zamanlı PCR aletinin J Infect Dis 2007;196:S199–S204. karşılık gelen detektör kanallarında Ebola ve Marburg virüsüne spesifik RNA'sının [11] ve ayrıca Dahili Kontrolün paralel olarak saptanması ve ayırt edilmesini mümkün Blasdell KR, Adams MM, Davis SS, Walsh SJ, Aziz-Boaron O, Klement E, et al. A reverse-transcription PCR method for detecting all known ephemeroviruses in clinical samp- kılar. les. J Virol Methods 2013;191:128–35. 10 11 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RNA virüslerinin nispeten hızlı moleküler evrimi nedeniyle zaman içinde Master A ve Master B reaktifleri tek bir reaksiyon kurulumunda revers transkripsi- mutasyonların birikiminin herhangi bir RT-PCR temelli test sisteminde yalancı yonu, PCR aracılıklı amplifikasyonu ve hedef saptamayı (Filovirüse spesifik RNA negatif sonuçlara neden olması şeklinde bir risk, sistemin doğası gereği mevcuttur. ve Dahili Kontrol) mümkün kılacak tüm bileşenleri (tampon, enzimler, primerler ve Analiz tasarımı Aralık 2013'te Genebank'te yayımlanmış sekans bilgisini temel alır. problar) içerir. Henüz bilinmeyen yeni suşlar ve türlerin oluşması bir primer/prob seti güncellemesini 7. UyarılarveÖnlemler gerekli kılabilir. • • Numunelere daima enfeksiyöz ve/veya biyolojik olarak tehlikeliymiş gibi ve güvenli laboratuvar işlemleriyle uyumlu şekilde muamele edilmelidir. • Numunelerin muamelesi sırasında koruyucu tek kullanımlık pudrasız eldivenler, laboratuvar önlüğü ve göz koruması kullanın. • Numune ve kit bileşenlerinin mikrobiyal ve nükleaz (DNase/RNase) kontaminasyonundan kaçının. • Daima aerosol bariyerli, DNase/RNase içermeyen tek kullanımlık pipet uçları kullanın. • Kit bileşenlerinin kullanımı sırasında daima koruyucu tek kullanımlık pudrasız eldivenler kullanın. • Şu işlemler için ayrılmış ve bölünmüş çalışma alanları kullanın: (i) numune hazırlama, (ii) reaksiyon kurulumu ve (iii) amplifikasyon/saptama aktiviteleri. Laboratuvarda iş akışı tek yönlü olarak ilerlemelidir. Daima her bölgede tek kullanımlık eldivenler kullanın ve farklı bölgelere girmeden bunları değiştirin. • Ayrı çalışma alanlarına ayrı malzeme ve ekipman tahsis edin ve bunları bir alandan ötekine taşımayın. • Pozitif olan ve/veya olabilecek materyali kitin tüm diğer bileşenlerinden ayrı olarak saklayın. • Amplikonlarla kontaminasyondan kaçınmak için amplifikasyondan sonra reaksiyon tüplerini/plakaları açmayın. • Pozitif Kontrol Hedefi Ebola Yerel, bölgesel ve/veya ulusal düzenlemeler veya akreditasyon organizasyonlarının kılavuz ilkeleri veya gerekliliklerine göre ek kontroller test edilebilir. • Kitin son kullanma tarihi geçmiş bileşenlerini kullanmayın. Pozitif Kontrol Hedefi Marburg • Örnek ve test atığını yerel güvenlik düzenlemelerinize uygun olarak atın. • Hedef RNA'nın cDNA'ya revers transkripsiyonu • Hedef cDNA ve Dahili Kontrolün PCR amplifikasyonu • PCR amplikonlarının floresan boya etiketli problarla eş zamanlı saptanması RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 şu gerçek zamanlı PCR aletleriyle kullanılmak üzere geliştirilmiş ve doğrulanmıştır: • Mx 3005P™ QPCR System (Stratagene) • VERSANT® kPCR Molecular System AD (Siemens) • ABI Prism® 7500 SDS and 7500 Fast SDS (Applied Biosystems) • LightCycler® 480 Instrument II (Roche) • Rotor-Gene® 3000/6000 (Corbett Research) • Rotor-Gene® Q 5/6 plex Platform (QIAGEN) • CFX96™ system/Dx real-time system (BIO-RAD) RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 şunlardan oluşur: • İki Ana reaktif (Master A ve Master B) • Şablon Dahili Kontrol (IC) • İki Pozitif Kontrol: • 12 Bu ürünün kullanımı gerçek zamanlı PCR ve in vitro diagnostik işlemlerin teknikleri konusunda özel talimat almış ve eğitilmiş personelle sınırlıdır. Test, tek bir tüp analizinde üç süreçten oluşur: PCR sınıfı su 13 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 8. KullanmaTalimatı Ön muamele ve örnek hazırlama açısından ek bilgi ve teknik destek için Teknik Destek kısmımızla irtibat kurun: 8.1 ÖrnekHazırlama RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 için başlangıç materyali ekstraksiyon ® e-posta: support@altona-diagnostics.com telefon: +49-(0)40-5480676-0 yapılmış RNA'dır. Ekstraksiyon yapılmış RNA'nın kalitesinin tüm test sisteminin performansı üzerine çok önemli bir etkisi vardır. Nükleik asit ekstraksiyonu için kullanılan sistemin gerçek zamanlı PCR teknolojisiyle uyumlu olduğundan emin olmak 8.2 MasterMixHazırlanışı gerekir. Tüm reaktifler ve örnekler kullanımdan önce tamamen çözülmeli, karıştırılmalı Şu nükleik asit ekstraksiyon kiti önerilir: • QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) Etanol içeren yıkama tamponları içeren bir spin kolon temelli örnek hazırlama işlemi (pipetleme veya hafif vorteksleme ile) ve kısa süre santrifüje konmalıdır. RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0, bir RT-PCR inhibisyonu kontrolü ya da örnek hazırlama işlemi (nükleik asit ekstraksiyonu) kontrolü ve RT-PCR inhibisyonu kontrolü olarak kullanılabilecek bir heterolog Dahili Kontrol (IC) içerir. kullanıyorsanız nükleik asit elüsyonu öncesinde yeni bir toplama tüpü kullanılarak yaklaşık 17000 x g (~ 13000 devir/dk) hızında 10 dakika boyunca ek bir santrifügasyon adımı kuvvetle önerilir. • Eğer IC bir RT-PCR inhibisyonu kontrolü olarak kullanılır ama örnek hazırlama işlemi için bir kontrol olarak kullanılmazsa, Master Mix şu pipetleme şemasına göre oluşturulur: NOT 1 12 Master A 5 µl 60 µl Master B 15 µl 180 µl 1 µl 12 µl 21 µl 252 µl ReaksiyonSayısı(rxns) Ekstraksiyonunverimliliğiveekstraksiyonuyapılannükleikasidin stabilitesiaçısındantaşıyıcıRNAkullanılmasıelzemdir. EtanolgerçekzamanlıPCR'dagüçlübirinhibitördür.Örnekhazırlamasisteminizetanoliçerenyıkamatamponlarıkullanıyorsa,nükleik Dahili Kontrol asit elüsyonundan önce tüm etanol izlerini giderdiğinizden emin MasterMixHacmi olmanızgerekir. 14 15 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 • Eğer IC örnek hazırlama işlemi için bir kontrol ve bir RT-PCR inhibisyonu 8.3 ReaksiyonHazırlanışı kontrolü olarak kullanılıyorsa IC'nin nükleik asit ekstraksiyonu işlemi sırasında • eklenmesi gerekir. Uygun bir optik 96 kuyulu reaksiyon plakası veya uygun optik reaksiyon tüpünün gerekli her kuyusuna 20 μl Master Mix pipetleyin. • Nükleik asit ekstraksiyonu için hangi yöntem/sistem kullanılırsa kullanılsın, IC • Örnekten 10 μl (nükleik asit ekstraksiyonundan elüt) veya kontrollerden 10 μl (Pozitif veya Negatif Kontrol) ekleyin. • Her çalışma için Pozitif Kontrollerin her birinden birer adet ve en az bir Negatif Kontrol kullanıldığından emin olun. • Örnekleri ve kontrolleri yukarı aşağı pipetleme yoluyla Master Mix ile iyice karıştırın. • 96 kuyuluk reaksiyon plakasını uygun bir optik yapışkan filmle kapatın ve reaksiyon tüplerini uygun kapaklarla kapatın. • 96 kuyuluk reaksiyon plakasını bir mikrotitre plakası rotorunda 30 saniye boyunca yaklaşık 1000 x g (~ 3000 devir/dk) hızında santrifüje edin. numuneye doğrudan eklenmemelidir. IC daima numune/izis tamponu karışımına eklenmelidir. Eklenmesi gereken IC hacmi daima ve sadece elüsyon hacmine bağlıdır. Elüsyon hacminin %10'unu temsil eder. Örneğin nükleik asit elüsyonu 60 µl elüsyon tamponu veya suda yapılacaksa numune/ lizis tamponu karışımına örnek başına 6 µl IC eklenmelidir. NOT Dahilikontrolüasladoğrudannumuneyeeklemeyin! • Eğer IC örnek hazırlama işlemi sırasında eklenmişse Master Mix şu pipetleme şemasına göre hazırlanır: 1 12 Master A 5 µl 60 µl Master B 15 µl 180 µl MasterMixHacmi 20 µl 240 µl ReaksiyonSayısı(rxns) 16 ReaksiyonKurulumu Master Mix 20 µl Örnek veya Kontrol 10 µl ToplamHacim 30 µl 17 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 9. GerçekZamanlıPCRAletleriniProgramlama 9.3 Farklı gerçek zamanlı PCR aletlerinin kurulumu ve programlanması hakkında temel • SıcaklıkProfiliveBoyaAlma Sıcaklık profili ve boya alınmasını tanımlayın: bilgi için lütfen ilgili aletin kılavuzuna başvurun. RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 ürününün belirli gerçek zamanlı PCR Evre DöngüTekrarı Alma Sıcaklık Zaman Revers Transkripsiyon Tutma 1 - 55 °C 20:00 dk Denatürasyon Tutma 1 - 95 °C 02:00 dk - 95 °C 00:15 dk √ 58 °C 00:45 dk - 72 °C 00:15 dk aletlerinde kullanımıyla ilgili ayrıntılı programlama talimatı için lütfen Teknik Destek kısmımızla irtibat kurun. 9.1 • Ayarlar Şu ayarları tanımlayın: Amplifikasyon Döngüleme Ayarlar Reaksiyon Hacmi 45 30 µl Rampa Hızı Varsayılan Pasif Referans 10. Yok VeriAnalizi Belirli gerçek zamanlı PCR aletlerinde veri analizi hakkında temel bilgi için lütfen ilgili aletin kılavuzuna başvurun. RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 ürününün farklı gerçek zamanlı PCR 9.2 FloresanDetektörleri(Boyalar) aletlerinde kullanımıyla ilgili ayrıntılı programlama talimatı için lütfen Teknik Destek kısmımızla irtibat kurun. • Floresan detektörleri (boyalar) tanımlayın: Saptama Ebolavirüse spesifik RNA Marburg virüsüne spesifik RNA Dahili Kontrol 18 DetektörAdı Reporter Quencher Ebolavirüs FAM (Yok) Marburg virüsü Cy5 (Yok) IC JOE (Yok) 19 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 10.1 DiagnostikTestÇalışmalarınınGeçerliliği 10.2 10.1.1 GeçerliDiagnostikTestÇalışması Geçerlibir diagnostik test çalışması için şu kontrol koşulları karşılanmalıdır: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 KontrolKimliği FAM Saptama Kanalı Cy5 Saptama Kanalı JOE Saptama Kanalı Pozitif Kontrol Ebolavirüs POZİTİF NEGATİF POZİTİF Pozitif Kontrol Marburg virüsü NEGATİF POZİTİF POZİTİF Negatif Kontrol NEGATİF NEGATİF POZİTİF 10.1.2 GeçersizDiagnostikTestÇalışması Bir diagnostik test çalışması şu durumlarda geçersizdir: (i) çalışma tamamlanma- SonuçlarınYorumlanması Örnek Kimliği FAM Saptama Kanalı Cy5 Saptama Kanalı JOE Saptama Kanalı A POZİTİF NEGATİF POZİTİF* Ebolavirüse spesifik RNA saptandı. B NEGATİF POZİTİF POZİTİF* Marburg virüsüne spesifik RNA saptandı. POZİTİF Ebola veya Marburg virüsüne spesifik RNA saptanmadı. Örnek, Ebola veya Marburg virüsüne spesifik RNA'yı saptanabilir miktarlarda içermiyor. NEGATİF PCR inhibisyonu veya reaktif hatası. Testi orijinal örnekten tekrarlayın veya yeni bir örnek toplayın ve test edin. C D NEGATİF NEGATİF NEGATİF NEGATİF Sonuçların Yorumlanması dıysa veya (ii) geçerlibir diagnostik test çalışması için kontrol koşullarından herhangi biri karşılanmadıysa. * JOE saptama kanalında Dahili Kontrolün saptanması, FAM saptama kanalı veya Cy5 saptama kanalında pozitif sonuçlar için gerekli değildir. Örnekte yüksek filovirüs yükü azalmış Geçersizbirdiagnostik test çalışması durumunda testi kalan saflaştırılmış nükleik veya bulunmayan Dahili Kontrol sinyallerine neden olabilir. asitleri kullanarak tekrarlayın veya orijinal örneklerle tekrar başlayın. 20 21 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 11. PerformansDeğerlendirmesi Tablo 2: ZEBOV spesifik RNA analitik hassasiyetini hesaplamak için kullanılan RT-PCR sonuçları, RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 11.1 ZEBOVGabon2003 AnalitikHassasiyet GirişKons. [kopya/µl] Replikat Sayısı PozitifSayısı Belirlenme Oranı[%] Dahili Kontrol 31,6 12 12 100 Geçerli 10 12 12 100 Geçerli 3,16 12 12 100 Geçerli 1,0 12 11 91,7 Geçerli MARV Popp, ZEBOV Gabon 2003 ve SEBOV Gulu için %95 LoD (saptama limiti) 0,316 12 7 58,3 Geçerli hesaplanması için oluşturulan veriler sırasıyla aşağıda Tablo 1, 2 ve 3'te 0,1 12 4 33,3 Geçerli 0,03 12 1 8,3 Geçerli 0,01 12 0 0 Geçerli NTC 12 0 0 Geçerli RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 analitik hassasiyeti, ≥ %95 pozitiflik ® oranıyla saptanabilen Ebola veya Marburg virüsüne spesifik RNA molekülleri konsantrasyonu (μl elüt başına kopya) olarak tanımlanır. Analitik hassasiyet, bilinen konsantrasyonda MARV Popp, SEBOV Gulu ve ZEBOV Gabon 2003 için spesifik in vitro transkriptlerin (İVT) dilüsyon serilerinin analiziyle belirlenmiştir. özetlenmiştir. Tablo 1: MARV spesifik RNA analitik hassasiyetini hesaplamak için kullanılan RT-PCR sonuçları, RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 MARVPopp 22 GirişKons. [kopya/µl] Replikat Sayısı PozitifSayısı Belirlenme Oranı[%] Dahili Kontrol 31,6 12 12 100 Geçerli 10 12 12 100 Geçerli 3,16 12 12 100 Geçerli 1,0 12 12 100 Geçerli 0,316 12 8 66,7 Geçerli 0,1 12 2 16,7 Geçerli 0,03 12 0 0 Geçerli 0,01 12 1 8,3 Geçerli NTC 12 0 0 Geçerli 23 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 Tablo 3: SEBOV spesifik RNA analitik hassasiyeti hesaplamak için kullanılan RT-PCR 11.2 AnalitikÖzgüllük sonuçları, RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kitinin analitik özgüllüğü oligonükleotidlerin SEBOVGulu (primerler ve problar) kapsamlı bir şekilde seçilmesiyle sağlanır. Oligonükleotidler tüm bilinen Ebola ve Marburg virüsü varyantlarının saptanacağından emin olmak GirişKons. [kopya/µl] Replikat Sayısı PozitifSayısı Belirlenme Oranı[%] Dahili Kontrol 31,6 12 12 100 Geçerli 10 12 12 100 Geçerli RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 analitik özgüllüğü Marburg virüsü ve 3,16 12 7 58,3 Geçerli Ebola virüsü ile ilişkili ve/veya benzer belirtilere yol açabilecek farklı patojenlerden 1,0 12 1 8,3 Geçerli ekstraksiyonla 0,316 12 0 0 Geçerli 0,1 12 0 0 Geçerli 0,03 12 0 0 Geçerli 0,01 12 0 0 Geçerli NTC 12 0 0 Geçerli için sekans karşılaştırma analizi kullanılarak halka açık mevcut sekanslarla kontrol edilmiştir. alınmış bir genomik RNA/DNA panelinin test edilmesiyle değerlendirilmiştir. RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 analitik hassasiyeti Probit analiziyle belirlenmiştir. MARV'a özgül RNA için: 1,16 kopya/μl [%95 güven aralığı: 0,22-11,67 kopya/μl] ZEBOV'a özgül RNA için: 1,39 kopya/μl [%95 güven aralığı: 0,69-5,32 kopya/µl] SEBOV'a özgül RNA için: 6,75 kopya/μl [%95 güven aralığı: 4,25-24,58 kopya/µl] . 24 25 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 Tablo 4: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 analitik özgüllüğünü göstermek üzere test Tablo 4 devam: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 analitik özgüllüğünü göstermek edilen organizmalar üzere test edilen organizmalar RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 ® FAM (Hedef Ebola) Cy5 (Hedef Marburg) JOE (IC) Organizmalar FAM (Hedef Ebola) Cy5 (Hedef Marburg) JOE (IC) Japon ensefalit virüsü Negatif Negatif Geçerli Junin virüsü XJ Negatif Negatif Geçerli Saint Louis ensefalit virüsü Negatif Negatif Geçerli Machupo virüsü Carvallo Negatif Negatif Geçerli Batı Nil virüsü, NY99 Negatif Negatif Geçerli Sabia virüsü SPH114202 Negatif Negatif Geçerli Batı Nil virüsü, Uganda Negatif Negatif Geçerli Guanarito Virüsü INH-95551 Negatif Negatif Geçerli Sarı Humma virüsü Negatif Negatif Geçerli VSV Indiana Negatif Negatif Geçerli Murray Vadisi ensefaliti virüsü Negatif Negatif Geçerli Rift Vadisi ateşi virüsü MP 12 Negatif Negatif Geçerli Negatif Negatif Geçerli Organizmalar 26 Zika virüsü Negatif Negatif Geçerli Hantaan virüsü 76-118 Kene ile taşınan ensefalit virüsü Negatif Negatif Geçerli ZEBOV Gabon 2003 Pozitif Negatif Geçerli Usutu virüsü Negatif Negatif Geçerli ZEBOV Mayinga Pozitif Negatif Geçerli Dang virüsü 1 Negatif Negatif Geçerli ZEBOV 2014/Gueckedou-C05 Pozitif Negatif Geçerli Dang virüsü 2 Negatif Negatif Geçerli SEBOV Gulu Pozitif Negatif Geçerli Dang virüsü 3 Negatif Negatif Geçerli TAFV Pozitif Negatif Geçerli Dang virüsü 4 Negatif Negatif Geçerli RESTV Pozitif Negatif Geçerli Hepatit C virüsü Negatif Negatif Geçerli MARV Musoke Negatif Pozitif Geçerli Batı Nil virüsü NY99 D Negatif Negatif Geçerli MARV Popp Negatif Pozitif Geçerli Hepatit A virüsü Negatif Negatif Geçerli MARV Leiden Negatif Pozitif Geçerli Hepatit E virüsü Negatif Negatif Geçerli CCHFV Afg09-2990 Negatif Negatif Geçerli Lassa virüsü Nig08-A37 Negatif Negatif Geçerli Lassa virüsü CSF Negatif Negatif Geçerli Lassa virüsü Lib05-1580/121 Negatif Negatif Geçerli Lassa virüsü AV Negatif Negatif Geçerli RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 belirtilen organizmalardan hiçbiriyle reaksiyona girmemiştir. 27 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 11.3 Kesinlik Tablo 6: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 MARV RNA spesifik saptama sisteminin kesinlik verileri RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 kesinlik verileri, analiz içi değişkenlik (bir ® deney içinde değişkenlik), analizler arası değişkenlik (farklı deneyler arasında değişkenlik) ve lotlar arasında değişkenlik (farklı üretim lotları arasında değişkenlik) Kesinlik şeklinde belirlenmiştir. Değişkenlik verileri ortalama değer, standart sapma, varyans ve varyasyon katsayısı olarak eşik döngüsü (Ct) değerleri temelinde ifade edilmiştir. Örnek başına en az atı replikat, analiz içi değişkenlik, analizler arası değişkenlik ve lotlar arası değişkenlik Analiz İçi Değişkenlik için analiz edilmiştir. Toplam varyans üç analiz kombine edilerek hesaplanmıştır. Tablo 5: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 ZEBOV RNA spesifik saptama sisteminin kesinlik verileri Kesinlik Analiz İçi Değişkenlik Analizler Arası Değişkenlik Örnek konsantrasyonu [kopya/μl] Ortalama Ctdeğerleri Standart Sapma Varyans 30 31,56 0,17 0,03 0,54 10 32,80 0,12 0,01 0,36 30 31,85 0,32 0,10 1,02 10 33,07 0,34 0,12 1,04 Varyasyon Katsayısı (%) Analizler Arası Değişkenlik Lotlar Arası Değişkenlik Toplam Varyans Örnek konsantrasyonu [kopya/μl] Ortalama Ctdeğerleri Standart Sapma Varyans 30 30,71 0,27 0,07 0,88 10 31,82 0,25 0,06 0,80 30 30,86 0,24 0,06 0,79 10 32,06 0,32 0,10 0,99 30 30,83 0,21 0,05 0,69 10 32,03 0,30 0,09 0,93 30 30,79 0,23 0,05 0,75 10 31,96 0,29 0,09 0,92 Varyasyon Katsayısı (%) Dahili kontrol saptama sistemi için oluşturulan kesinlik verileri sırasıyla 30 ve 10 viral Lotlar Arası Değişkenlik Toplam Varyans 28 30 31,76 0,40 0,16 1,26 10 33,03 0,44 0,20 1,35 30 31,70 0,35 0,12 1,10 10 32,95 0,38 0,15 1,16 hedef kopya içeren örnekler için tablo 7 ve 8'de özetlenmiştir. 29 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 Tablo 7: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 IC saptama sistemi için oluşturulan Tablo 8: RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 IC saptama sistemi için oluşturulan kesinlik verileri 30 hedef kopya/μl içeren örnekler için sırasıyla ZEBOV ve MARV ile kesinlik verileri 10 hedef kopya/μl içeren örnekler için sırasıyla ZEBOV ve MARV ile belirlenmiştir belirlenmiştir Kesinlik Analiz İçi Değişkenlik Analizler Arası Değişkenlik Lotlar Arası Değişkenlik Toplam Varyans 30 Varyasyon Katsayısı (%) 30kopya/μl Ortalama Ctdeğerleri Standart Sapma Varyans ZEBOV 28,98 0,05 0,00 0,19 MARV 28,90 0,09 0,01 0,32 ZEBOV 29,32 0,36 0,13 1,23 MARV 29,26 0,39 0,15 1,32 ZEBOV 29,26 0,43 0,19 1,48 MARV 29,22 0,43 0,18 1,47 ZEBOV 29,16 0,37 0,14 1,29 MARV 29,11 0,38 0,15 1,31 Kesinlik Analiz İçi Değişkenlik Analizler Arası Değişkenlik Lotlar Arası Değişkenlik Toplam Varyans Varyasyon Katsayısı (%) 10kopya/μl Ortalama Ctdeğerleri Standart Sapma Varyans ZEBOV 29,09 0,05 0,00 0,17 MARV 29,02 0,07 0,01 0,26 ZEBOV 29,41 0,34 0,12 1,16 MARV 29,34 0,34 0,12 1,17 ZEBOV 29,32 0,43 0,19 1,48 MARV 29,28 0,41 0,17 1,40 ZEBOV 29,24 0,37 0,14 1,26 MARV 29,19 0,35 0,13 1,21 31 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 12. • SınırlamalarveÖnlemler 13. Kalite Kontrol Bu ürünün kullanımı gerçek zamanlı PCR ve in vitro diagnostik işlemlerin altona Diagnostics GmbH ISO EN 13485 sertifikalı Kalite Yönetimi Sistemi uyarınca teknikleri konusunda özel talimat almış ve eğitilmiş personelle sınırlıdır. her RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 lotu tutarlı ürün kalitesini garanti • Bu analizin uygun şekilde yapılması için iyi laboratuvar uygulamaları şarttır. Kit ve reaksiyon adımlarının bileşenlerinin saflığını korumak için çok dikkatli olunmalıdır. Tüm reaktifler safsızlık ve kontaminasyon açısından yakından izlenmelidir. Herhangi bir şüpheli reaktif atılmalıdır. etmek üzere önceden belirlenmiş spesifikasyonlara göre test edilir. • Testin optimum performansı için uygun numune toplama, taşıma, saklama ve işleme işlemleri gereklidir. • Test doğrudan numune üzerinde kullanılmamalıdır. Bu analizin kullanılmasından önce uygun nükleik asit ekstraksiyon yöntemlerinin kullanılması gerekir. Müşteri Desteği için lütfen Teknik Destek kısmımızla irtibat kurun: • RT-PCR inhibitörlerinin varlığı yalancı negatif veya geçersiz sonuçlara neden olabilir. • Testin primer ve/veya problarının kapsadığı virüs genomu hedef bölgelerinde olası mutasyonlar patojenlerin varlığının saptanamamasıyla sonuçlanabilir. • Her diagnostik testle olduğu gibi RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 sonuçları tüm klinik ve laboratuvar bulguları dikkate alınarak yorumlanmalıdır. 14. 15. TeknikYardım e-posta: support@altona-diagnostics.com telefon: +49-(0)40-5480676-0 TicariMarkalarveRetBeyanları RealStar® (altona Diagnostics GmbH); Mx 3005P™ (Stratagene); ABI Prism® (Applied Biosystems); LightCycler® (Roche); Rotor-Gene®, QIAamp® (QIAGEN); VERSANT® (Siemens); CFX96™ (BIO-RAD). Bu belgede kullanılan tescilli isimler, ticari markalar vs. bu şekilde işaretlenmemiş olsalar bile kanunen koruma altında olmadıkları düşünülmez. RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0, Avrupa in vitro diagnostik direktifi 98/79/EC uyarınca bir CE işaretli diagnostik kittir. Tüm ülkelerde sağlanmamaktadır. © 2014 altona Diagnostics GmbH; tüm hakları saklıdır. 32 33 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 16. SembollerinAçıklaması Notlar In vitro diagnostik tıbbi cihaz Ürün numarası Lot kodu İçindekiler “n” test/reaksiyon için yeterlidir (rxns) Sıcaklık sınırlaması Versiyon Son kullanma tarihi Dikkat Kullanma talimatına başvurun Üretici 34 35 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 36 RealStar® Filovirus Screen RT-PCR Kit 1.0 37