İrem Akar Soycan
Transkript
İrem Akar Soycan
AKIM SİTOMETRİ PRENSİPLERİ İrem Akar Soycan (Becton Dickinson) Flow sitometri; Belli bir hızda akan hücreleri eş zamanlı olarak farklı özelliklerine göre tanımlayan sistemdir. 2 Ortak özellikleri nedir? alg Kan hücreleri 3 kromozomlar protozoa Hücre Hakkında Bize Ne Söyler? — Yaklaşık büyüklüğünü (Forward Scatter-FSC) — Yaklaşık granüllüğünü (Side Scatter-SSC) — Yaklaşık floresans miktarını (FL1, FL2, FL3 ve FL4) 4 FSC ve SSC Özellikleri Side Scatter Detektörü Hücrenin içsel yapısı Laserden gelen ışık kaynağı Forward Side Scatter Detektörü Hücre büyüklüğü Forward Scatter— yüzeyden yansıyan ışınlar — Hücrenin büyüklüğü ile ilişkilidir. Side Scatter— içerden kırılıp yansıyan ışınlar — Hücrenin granüllüğü ve içsel yapısı ile ilgilidir. 5 600 Nötrofiller 400 Side Scatter 800 1000 Eritrositleri uzaklaştırılmış tam kan örneği 200 Monositler 0 Lenfositler 0 200 400 600 800 Forward Light Scatter 6 1000 Hücre Hakkında Bize Ne Söyler? — Yaklaşık büyüklüğünü (Forward Scatter-FSC) — Yaklaşık granüllüğünü (Side Scatter-SSC) — Yaklaşık floresans miktarını (FL1, FL2, FL3 ve FL4) 7 Fluoresan ışık nedir? λ = 488 nm HO O λ ≅ 530 nm C CO2H Işık enerjisi Fluoresan Molekülü Açığa çıkan ışık enerjisi Antikor — Florokrom laserden gelen enerjiyi emer. — Florokrom tarafından emilen enerji; – Vibrasyon ve ısı salınımı – Uzun dalga boylu fotonların emisyonu ile açığa çıkar. 8 Floresans yoğunluğu Salınan enerjinin miktarı, hücrede bulunan bağlanma bölgelerinin miktarı ile doğru orantılıdır. FITC FITC FITC FITC FITC Hücrelerin Sayısı FITC FITC FITC FITC Floresan Yoğunluğu 9 FITC Görüntüleme.. 10 Sitometri hangi sistemlerin varlığına ihtiyaç duyar? — Sıvı Sistem Hücrelerin lasere taşınması ve tek tek lazerden geçişini sağlar. — Optik Sistem Işık enerjisinin oluşmasını ve sonrasında da toplanmasını sağlar. — Elektronik Sistem Optik sinyallerin veri aktarımını sağlamak üzere dijital sinyallere çevrimini sağlar. 11 Sıvı Sistem-FACS Calibur Hava Flitresi Hava Pompası Flow Cell Sheath Düzenleyici Sheath Sheath Filitresi Atık Örnek geçiş düzenleyici Örnek 12 Sıvı Sistem–FACSCanto II Hava Filitresi FACSFlow tankıı tank Atık Tankı Compressor in wet cart Sheath Filitresi ™ FACSCanto Wet cart Sheath Regulator Flow Cell FACSCanto cihazı Plenum reservoir Sample Regulator Örnek tüpü 13 Sıvı Sistem:BD FACSAriaII Fluidic cart – Cihaza sıvı akışını sağlar ve vakum oluşturur. 14 Optik Sistem:FACSCalibur 4C FL1 530/30 SSC FL2 FL4 488/10 585/42 90/10 Beam Splitter 661/16 DM 560SP DM 640LP 670LP Yarım Ayna Floresans toplama lensi FL3 Beam Combiner 488 nm Blue Laser 15 Flow Cell Red Diode Laser ~635 nm 488/10 Odaklayıcı Lens FSC Diode Optik Sistem: FACS CantoII-Aria II To PMT Fiber optics Waste line 633 nm Kırmızı Lazer Collection lens Focusing Lens Beam reshape Pin hole block FSC 488 nm Mavi Lazer 405 nm Mor Lazer 488 / 10 FACSFlow Positive Differential Pressure 16 Diode Optik Sistem:FACSCanto II-Aria II Trigons 17 Octagon Elektronik Sistem — Optik sinyalleri voltaj değerlere dönüştürür. — Voltaj değerinin yüksekliğini, genişliğini ve alanını hesaplar. — Bilgi aktarımı görevi görür. 18 Laz Lazer Voltaj Voltaj değerinin oluşması Laz Lazer Voltaj Zaman Laz Lazer 19 Voltaj Zaman Zaman Alan Yükseklik Volt Hesaplanması.. 0 Genişlik Zaman (µ Saniye) 20 Verilerin Dijital Çevrimi Oluşan voltajların yükseklik değerlendirmeleri FSC Analogdan dijitale çevrim SSC Zaman Zaman FL1 Analogdan dijitale dönüştürücü GPIO Interface FL2 Zaman 0 1000 Kanallar FL3 Zaman FL4 Zaman 21 Zaman Dot Plot List-Mode Data 1000 SSC FL1 FL2 Event 1 30 60 638 840 Event 2 100 160 245 85 Event 3 300 650 160 720 1000 840 800 600 FL2 FL2 FSC 400 800 600 400 200 200 85 0 0 0 200 400 600 800 1000 0 200 FL1 FL1 245 22 400 600 800 638 1000 SSC FL2 Özet Zaman FL1 FSC Zaman Veri işlemcisi FSC SSC Zaman FL1 Zaman Zaman Zaman 23 FL2 FL3 FL4 Örnek Hazırlama 100 ul tam kan veya kemik iliği eklenir 20 ul floresan eklenir Vorteks 15 dk inkübasyon 2 ml BD Lysis Buffer eklenir Vorteks 10 dk inkübasyon Santrifüj edilerek süpernatant uzaklaştırılır. Hücreler yıkanır ve analize geçilir. 24 Florokromların floresan yoğunlukları — — — — — — — — — — — 25 BD Anti-CD4’ün CompBeadler üzerindeki yoğunlukları FITC=1 PE-Cy7=4.9 APC=5.8 PE=4.3 PerCP-Cy5.5=1.5 Alexa700=0.91 APC-Cy7=1.2 PerCP=0.68 Pacific Blue=0.15 AmCyan=0.1 Florokromlar —Antijenin düşük seviyede ifade edildiği durumlarda florokromun yüksek seviyede ışıma vermesi gerekir. 26 27 Neden Hücre Ayırırız? Bir ya da birkaç farklı hücre populasyonu izole etmek için; 28 Damla Oluşturulması — Amplitude – Akıma uygulanan şiddeti belirler — Frequency – Saniyede meydana gelen damla sayısınısıklığını belirler. — Drop 1 – Görüntünün en üst noktası ile meydana gelen ilk damlanın orta noktası arasındaki pixel sayısıdır. — Gap – Oluşan ilk bağımsız damla ile akım arasındaki pixel sayısıdır. 29 Hücre ayrıştırması(Sorting):Nasıl? Analiz edildiği an = hücrenin lazere çarptığı an Drop Delay; hücrenin A noktasından B noktasına ulaşması sırasında geçen süredir. Damla sayısı ile ifade edilir. A B 30 Elektrik yüklendiği an = ayrılma noktası Sorting Bir kablo yardımı ile akıma elektrik yüklenir Örneğin oluşturduğu ışık saçılımları ve floresan sinyalleri analiz edilir. Elektrik yüklü damlacıklar oluşur. plakalar aracılığı ile yüklü damlacık tüplere yönlendirilir. Yüklü olmayan damlacıklar atık tankına gider. 31 Sort edilmesi istenen partikülleri içeren yüklenmiş damlalar toplanır. Sorting öncesi ve sonrası saflık değerlendirmesi Sort öncesi örnek dağılımı CD3+ TCR+ Quadrant Statistics Acquisition Date: 22-Apr-99 X Parameter: FL1 (Log) Y Parameter: FL2 (Log) Quad UL UR LL LR CD3+ ve TCR+ Hücrelerin sort sonrası dağılımı 3 % Gated 0.07 % Total 0.03 68 2071 1945 1.66 50.67 47.59 0.68 20.71 19.45 Quadrant Statistics Acquisition Date: 22-Apr-99 X Parameter: FL1 (Log) Y Parameter: FL2 (Log) Quad UL UR LL LR 32 Events Events % Gated 0 0.00 177 0 1 99.44 0.00 0.56 % Total 0.00 78.67 0.00 0.44 Saflık %’si Lösemide BCR-ABL •t(9;22) Kromozomal translokasyonu (Philadelphia kromozomu) BCR ve ABL genlerinin füzyonuna neden olur. • KML’de >%95 (tanı kriteri) • erişkin precursor B-ALL’de %25-40 • pediatric precursor B-ALL ‘de %3-6 oranında görülmektedir. 33 BCR-ABL Kalitatif Araştırma Kiti bead Çekirdek CBA BONCUĞU BAĞLI BCR ANTİKORU füzyon gen 5' BCR geni ABL geni bead transkripsyon Hücre translasyon B A FÜZYON PROTEİNİNİN YAKALANMASI Lizatı Patents: Sitoplazma US 6,610,498 B1 (26 August 2003) US 6,686,165 B2 (3 February 2004) 34 bead B Füzyon proteini PE FLOROKROMU İLE TESPİT EDİLMESİ Veri Alımı : BCR-ABL negatif BCR-ABL pozitif 35 BCR-ABL’nin tüm alt tiplerinin tanımlanması : 697 (t(1;19) TOM-1, BCR-ABL+ (neg. kontrol) (p190) LAMA-84, BCR-ABL+ (p210) AR230, BCR-ABL+ 36 (p230) Translokasyonların tespitinde kullanılan diğer metodlar Sitogenetik 37 FISH (RQ)-PCR Metodlara ait Parametreler 38 Metod Gereken Zaman Notlar Sitogenetik 3-10 gün Hücre kültürü ve birçok farklı ürün gerektirir. Manuel - Otomatize FISH 1-2 gün, (gönderilirse 2-7 gün) Manuel PCR 3 saat (gönderilirse 2-7 gün) Manuel - Otomatize Foxp3 (259D klonu)(BD) hakkında — Foxp3 T-regülatör hücrelerini tanımlamak için kullanılır. İnsan T-reg hücrelerini fonksiyonlarına göre belirlemek amaçlı CD127 ile birlikte kullanımı önerilmektedir. — BD bünyesinde insan T-reg hücrelerini bütünüyle incelemek amaçlı Foxp3 (hücre içi) ve CD127 (yüzey) içeren kitler mevcuttur. — Foxp3 259D klonu özgüllüğünden ötürü konu ile ilgili yayınlarda en çok görülen ürün olmuştur. 39 CD127; insan periferik kan tek çekiredekli hücrelerinden canlı T-reg hücrelerini ayırır. CD4+ kapılanmış hücrelerde CD127 ve CD25 işaretlenmesi gösterilmektedir. 40 T-reg hücrelerinin fenotipik analizleri Hücrelerin CD127 ve CD25 ifade etme özelliklerine göre incelenmiştir. CD25 düşük/CD127 yüksek CD4 - PerCP CD127yüksek hücreler, Foxp3’ü neredeyse hiç ifade etmezler. CD25 yüksek/CD127 düşük CD4 - PerCP CD127 düşük hücrelerde Foxp3 ifadesi yüksektir. 41 İsotipik kontrol-APC Foxp3 APC Foxp3 APC BD Stem Cell Enumeration Kit — CD45 FITC/CD34 PE — Ammonium Chloride Liziz solüsyonu 10x — 7-aminoactinomycin-D AAD) — BD TrucountTM tüpleri — Kit başına 50 test — Okutma ve analiz için oluşturulmuş kalıplar 42 (7- BD Trucount Mutlak Sayım Tüpleri — Mutlak sayı vermek amaçlı BD Stem Cell Enumeration kit ile kullanılır. — Lyophilize edilmiş ve bilinen sayıda floresan işaretli boncuk içeren pelletten meydana gelir. 43 Çalışılabilecek Örnek Tipleri —Periferik Kan —Kemik İliği —Aferez Ürünü —Kordon Kanı 44 Veri analizi.. Hesaplama için gereken veriler Kapı İstatistikleri Sonuçlar 45 Teşekkür Ederim.. İrem Akar Soycan 46