Histopatolojinin Gelişimi - Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi
Transkript
Histopatolojinin Gelişimi - Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi
A.Ü. Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji ABD web sayfası HİSTOPATOLOJİNİN GELİŞİMİ SANATTAN BİLİME Yazan: John D. Bancroft, Patolog, Nottingham Çeviren: Dr. Serçin Karahüseyinoğlu Böylece 19. yüzyılın sonunda ışık mikroskobuna özgü çözünürlük teorisi sınırları zorladı. Elde edilen kontrastın çok düşük olması nedeniyle doku boyamalarına ağırlık verildi. Dokuların ayrıntılı incelenmesi ve histolojinin insan patolojisi alanında uygulanması yönünde çalışmalar hızlandı. Bileşik mikroskobun icadı tartışmalı olsa da, ilk ürün Hollanda’lı Jannssen Kardeşlere mal olmuştur. Bu aygıtın gerçek tanıtımı ise, aynı tarihlerde daha iyi bir mikroskop yapan yine Hollanda’dan Drebbelin tarafından yapılmıştır. Başka bir Hollandalı olan Leeuwenhoek ise mikroskopların popülerleşmesini sağlamıştır. Elektron demetinin dalga özelliğinin fark edilmesiyle çözünürlükte önemli derecede ilerleme sağlandı. 1924’te Busch, bir elektron demetinin solenoidle üretilmiş manyetik alandan geçirildiğinde odaklanabileceğini gösterdi. Elektron demetinin bu iki özelliği Ruska ve Knoll’un 1931’de ilk geçirimli elektron mikroskobunu yapmasını sağladı. Sadece 17 kez büyütmesi olmasına karşın bu mikroskop elektron optiğinin temel prensiplerini ortaya koydu. 1930’ların ortalarına gelindiğinde Almanya ve İngiltere’de elektron mikroskoplarının prototipleri yapılmaya başlandı. Ancak II. Dünya Savaşı Avrupa’yı ve güneydoğu Asya’yı sardığında bu kıtalardaki ilerlemelerin tümü ertelendi. Yine de, hücre ve dokulardaki ince yapıyı inceleme konusundaki istek, elektron optiğindeki ilerlemeleri sürdürdü. Mikroskobun önemi 19. yüzyılın başlarında pek anlaşılamadı. Ancak 1820’lerden sonra büyük ilerlemeler kaydedildi. 19. yüzyılın ortalarında, hobi olarak bilimle uğraşan bir şarap tüccarı ve aynı zamanda antisepsi konusunda ün yapmış Joseph Lister’ın babası olan Lister, akromatik objektifi geliştirdi. Abbe, objektiflerini geliştirmenin yanı sıra mikroskoba kondansörü ekledi. Geçen sürede birçok başka gelişmeler oldu ve mikroskopi eğlence olmak yerine bilim ve tıp alanında vazgeçilmez hale geldi. Kesitlerin kalın olması ve uygun olmayan boyalara karşın bazı histolojik yapıların ayrıntıları izlenebilmekteydi. 1870’lerde ışık mikroskobunda önemli gelişmeler yaşandı. Dekadın başında ilk üretim İngilizlerin elindeydi, ancak objektiflerin çoğu deneme yanılma yoluyla biraraya getiriliyordu. Almanya’dan Ernest Abbe üretimi standart hale getirmeyi başardı ve objektifler standart şekilde üretilmeye başlandı. Modern elektron mikroskobu, biyolojik örneklerde olmasa da teorik olarak 0.2 nm çözünürlüğe ulaşabilir. Buna alandaki gelişmeler, hücre içindeki ince yapının yanında hücre yüzeyini gösteren taramalı elektron mikroskobu, hücre içeriğinin kalitatif ve kantitatif değerlendirmesini yapan analitik elektron mikroskobu, kalın kesitlerin izlenebildiği ve 0.1 nm çözünürlüğe ulaşılan yüksek voltajlı elektron mikroskobu gibi diğer elektron temelli optik aletlerin bu alandaki kullanımlarını sağlamıştır. Bu yıllar, modern ışık mikroskobunun temelinin atıldığı yıllardı ve sonraki 20 yılda objektif mükemmele yakın hale getirildi. 1886’da Abbe apokromatik objektifi tanımladı. O tarihten kalan mercekler bugün bile çok iyi durumdadır ve şimdiye kadar üretilmiş en iyi objektiflerin bazılarında yer almaktadır. Dokuların korunmasını ve boyama yöntemleriyle uyumunu sağlayan tespit çözeltilerinin geliştirilmesi de, 1800’lü yılların erken dönemlerine rastlar. Tespit ve tespit 1 A.Ü. Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji ABD web sayfası Edwin Klebs Bern, Wurzburg, Prag, Zürih ve Şikago’da patoloji bölümünün başkanlığını başarıyla yapmış önemli biridir. 1970’lerde hücre patolojisi ve bakteriyoloji arasında ilgi kurmayı başarmış ve bu alana önemli katkıda bulunmuştur. Çok değerli parafine gömme yönteminin tanıtımını da bu sıra dışı öncüye atfediyoruz. Klebs parafine gömme yöntemini 1869’da tanıttı. Orijinal teknik, dokunun alınması, kurutulması, muma batırılıp dış yüzeyinin kaplanması, mum bloğuna yerleştirilmesi ve kesitlerin alınmasını içermekteydi. Mumun dokunun derinliklerine süzülmesini sağlamak için hiçbir çabada bulunulmamıştı. 1959’da Şikago’da McCormick kasetin öncüsü olan plastik gömme halkasını geliştirerek dokunun bloklanmasını sağladı. sıvıları hakkındaki bilgiler yıllar içerisinde ampirik gözlemlerin birikimleriyle oluşmuştur. M.S 400’lerde Hippocrates de Perslar gibi civanın biyolojik etkileri hakkında bilgi sahibiydi; alkolün karaciğer ve beyin üzerindeki koruyucu etkisi de uzun süredir bilinmekteydi. Histopatolojide tespit, kesit hazırlığıyla süren bir dizi işlemin temelini oluşturur. Herkes doku tespitinin karmaşık kimyasal olaylar dizisi olduğunu ve dokuların nasıl tespit edilmesi gerektiğini bilir, ancak işlemin basit şekilde tanımlanması mümkün değildir. Doku tespitinin amaçları nelerdir? Otoliz önlenmeli ve tespit edilmiş dokular boyanma sırasında şekil ve hacim değiştirmemelidir. Bu amaçlara nasıl ulaşılır? Kısa yanıt; ulaşılamaz’dır. Değişik gereksinimler arasında bir çeşit uzlaşma olmalıdır. Rutin teknikler dokuların mikroanatomisini yeteri kadar korur, ancak elektron mikroskobu, immünhistokimya gibi özelleşmiş yöntemler özgün tespit teknikleri gerektirebilir. Maalesef tespit sıvılarının sistemli bir biçimde incelenmesi 19. yüzyılın ikinci yarısına kadar gerçekleşememiştir. Bu yüzyılda hiçbir tespit sıvısının ideal olmadığı fark edilerek karışımlar üretildi. Fizik ve kimya alanlarındaki bilgilerimizin artması ve yeni geliştirilmiş tespit sıvıları önümüzdeki birkaç yılda tespitin rolünde değişmeler olabileceğini gösterse de tüm gereksinimleri karşılayabilecek tek bir tespit sıvısının eldesi hâlâ olası gözükmemektedir. 1966’da tanıtılan “Tissue-Tek” sistemi gömme istasyonu, taban kalıbı, kasetler ve kapatma işlevindeki materyali içermekteydi. Bence bu sistemin histoloji laboratuvarında kesit hazırlanması konusunda devrim yarattığını söylemek haksızlık olmaz. Geçen yıllar içinde selloidin ve şimdi de resin histolojik kesitler için kullanılan diğer gömme materyalleridir. İlk kez elektron mikroskobu kesitlerinde kullanılmakla birlikte bu maddeler daha sonra ışık mikroskobuyla yapılan çalışmalarda da tercih edilmiştir. Mikrodalga fırında tespit edilmiş dokuların daha kaliteli olma olasılığı vardır. Tespit işlemi birkaç dakikada tamamlanmakta ve bu da laboratuvar çalışmalarının hızla ilerlemesinde önemli bir etken olmaktadır. Isıtmanın bir tespit yöntemi olarak kullanılması 1898’de kan filmlerinde ilk kez uygulanmasından beri iyi bilinen bir geçmişe sahiptir. Isıtılmış tespit sıvısıyla yapılan işlemler geçmişte hızlı parafin kesitler elde etmek amacıyla da kullanılmış olup ve bazı araştırmacılarca hâlâ kullanılmaktadır. Mikrodalga fırında radyasyon uygulamasıyla ilgili bazı yayınlar bulunmakta ve mikrodalga fırınların elde edilebilirliği arttıkça bu yayınların sayısı da artmaktadır. Büyük olasılıkla mikroskopik araştırmalar için kullanılan en eski teknik kurutmaktı. Leeuwenhoek’un 1720’de bu metodu kullanarak kas dokusu örneklerini hazırladığı söylenir. Altmann tarafından 1890’da kullanılan yöntem küçük doku parçalarının sülfürik aside konmasından ibaretti. Birkaç gün sonra dokular mumun içine gömülüyürdu. Bu yöntemin pratikte kullanımı, 1932’de Gersh’in modern dondurarak kurutma cihazını üretimine kadar verimli değildi. Bu cihazda daha sonra birçok değişiklik - ki bunlardan biri 1963’te Pearse’ın tanıttığı termoelektrik dondurucu/kurutucudur - geliştirildi ve dondurma-kurutma yönteminin bugün araştırmalarda kullanılmasını sağladı. 2 A.Ü. Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji ABD web sayfası karmeni kullanmasına önayak oldu. 1858’de Gerlack karmen-jelatin enjeksiyonu sonrasında dokuların renklendiğini görerek karmen boyasını tekrar keşfetti. Amonyaklı karmenle boyama yapmaya çalıştı ancak başarılı sonuçlar elde edemedi. Bir beyin kesitinin seyreltik çözeltide bir gece beklediğinde sinir lifleri ve hücrelerin çok güzel boyanması ise şans dolu bir tesadüftü. 19. yüzyılın son çeyreğinde histologlar ışığı yeterince iletecek incelikteki kesitlere gerek duydular. İlk mikrotomlarda dokular çevrelerine sebzeler konularak destekleniyor ve böylelikle kesitler, dokular elle tutulmadan alınabiliyordu. Alman patologlar kesit alırken gerekli desteğin sağlanması amacıyla dokuyu donduruyorlardı ve bu konuda oldukça deneyimliydiler. 1856’da Londra Üniversitesi’nde öğrenci olan 19 yaşındaki William Perkins, anilin boyalarını keşfetti. Bu keşfin sonunda mikroskopi bilimi ve boya endüstrisinde devrim gerçekleşti. Perkins, kinin sentezlemeye yönelik çalışmaları başarısızlıkla sonuçlanınca mor boyalara ilgi duydu ve yeni bir araştırmaya yöneldi. Bu olay ilk anilin boyasının ve diğer boyaların keşfiyle sonuçlandı. Bu keşfin en yararlı olduğu alan tekstil endüstrisiydi ve bugün kullandığımız anilin boyalarının çoğu geliştirildi. Sonraki gelişme ise yine Almanya’da sentetik boya ürünlerinin kullanılması oldu. Bu boyalar yün ve pamuk içindi. Yedi fiberli boyalar doku boyaması için idealdi ve yüzyılın sonunda birçok ampirik histolojik boyama yöntemi yayınlandı. 1952’de kriyostat geliştirildi. Literatürdeki ilk model Morgensen ve Lindenstrom-Lang’ın 1938’de kantitatif sitokimya çalışmaları için geliştirdikleri modeldi. Kabinin arka tarafında kuru buz blokları vardı ve soğuk havanın bir fan yardımıyla çemberin içinde sürekli dolaşması sağlanıyordu. Kriyostatın bir özelliği de dönmeyi önleyici bir sistemin bıçağın dokuya uygulandığında düz, buruşuk olmayan kesitlerin alınmasına olanak sağlamasıydı. Bu kriyostatdan sedece kısa bir süre sonra, 1951’de Coons ve ark. başka bir model ürettiler. Bu model öncekini temel alıyordu, ancak bu modelde soğuk, çevre dondurma yöntemiyle sağlanıyordu. Ulaşılabilen en düşük sıcaklık -18oC’ydi ve bu sıcaklık taze, yumuşak dokulardan kesit alınabilmesi için yeterliydi. İngiltere’deki kriyostatların öncüsü, 1954’te Pearse’ın Coons modelini temel alarak ürettiği prototiptir. Pearse’ın kriyostatı da dondurma yöntemiyle soğutma yapıyordu ve -30oC’ye ulaşabiliyordu. Dönmeyi engelleyici plaka Coons modelindeki gibi bıçağa değil, mikrotoma tutturulmuştu. Son 30 yılda kriyostatların gelişimi, en önemlisi mikrotomlardaki iyileşme olmak üzere, birçok değişiklik getirmiştir. Kriyostat tekniğinin gerekliliklerinden olan dönmeyi önleyici plaka gelişmiş ekipmanın bir parçasını oluşturmuştur. Histologlar, hematoksilenin değerini çabuk anladılar. 1863’te Waldeyer bakkam ağacı özünün silindir akslarını boyamak için kullandı. 1865’te Bohmer hematoksilenin bilimsel fomüllerini histolojinin kullanımına sundu. Anilin boyaların ve hematoksilenin keşfi mikroskopinin hızla ilerlemesini sağladı ve 19. yüzyılın sonuna doğru birçok yeni yöntem tasarlandı. Boyalar üzerinde yapılan heyecanlı çalışmalar, bazı boyaların spesifik yapılara karşı affinite gösterdiğini ortaya koydu ve boyanmanın teorisini anlama çalışmaları başladı. Artık başarılı bir histolojik çalışma için gerekenler iyi kesitler, hücre komponentlerini ayırıcı boyalar ve bu yapıların gözlenebileceği mikroskoplardı. Hasta dokuların kaba görünümleri, postmortem dokuların histolojik özellikleri incelendi, bakteriler gözlemlendi, kültüre edildi ve sınıf- Daha önce iç kulağın yapısının incelenmesi amacıyla boyalar kullanılmış olsa da ilk kez 1849’da iki botanikçi bilim adamının karmeni boya olarak kullanmasıyla mikroskopik görüntüleme sağlandı. Bu botanik araştırması o zamanlarda pek dikkat çekmese de Hartig’in 1856’da bitkilerin klorofil granüllerini göstermek amacıyla 3 A.Ü. Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji ABD web sayfası maları sırasında Virchow’dan etkilendi. Franko-Prusya savaşında cerrah olarak hizmet verdikten sonra hastanede çalışmaya başladı. Çiçek hastalığının cilt erüpsiyonları üzerinde mikroskopik çalışmalar yaptı. Bu araştırma, koagülasyon nekrozu üzerindeki önemli çalışmasına öncülük etti. 1871’deki çiçek epidemisi onun iki alana ilgi duymasını sağladı. Bunlar, bulaşıcı hastalıklarda bakterilerin rolünü ortaya koymak ve histolojik tekniklerde deneyimli bir bilim adamı olarak bakterilerin boyanmasını sağlayacak araştırmalar yapmaktı. Karmen boyasını kullandı ve başarılı oldu. Bakterilerin doku kesitlerinde boyanmasıysa onun ödülüydü. Bu bakteriler aslında çiçek hastalığına sekonder olmasına karşın ileri araştırmaların hızlanmasını sağladı. Weigert büyük bir teknisyendi. Dokunun seri kesitlerinin alınmasını geliştirmek ve özel doku boyalarını hazırlamak onun bu bilime büyük katkıları oldu. landı. Böylece teorik ve pratik immünolojinin ilk adımları atıldı. Bunun yanı sıra sadece rutin hematoksilen-eozin boyaları değil bugün kullanılan birçok özel histolojik teknik ve en klasik örneği Perls’in hemosiderini boyama yöntemi olmak üzere birçok kimyasal tepkime bu zamandan orijin almaktadır. Bu dönemde bağ dokusu lifleri ve hücreleri gibi özelleşmiş yapılar ayırt edilebiliyordu. 1900’de Mallory, bağ dokusunun ayırıcı boyaması için trikrom yöntemini tanımladı. Bilimsel ve teolojik tartışmalar nedeniyle insan beynine gösterilen büyük ilgi, bugün bile geçerliliğini koruyan nörohistolojik yöntemlerin doğmasını sağladı. Merkez sinir sistemi hastalıkları hakkındaki bilgiler, öncü İtalyan nörohistolojist Golgi, İspanyol histolojistler Cajal ve Hortega’nın anatomi çalışmalarıyla geliştirildi. Cajal’ın sinir sistemi hücrelerini sınıflaması sonraki yıllarda beyin tümörlerinin yararlı ve sistemli biçimde sınıflanmasını sağlayan önemli bir kilometre taşıydı. Bu gelişime katkıda bulunanlara bir göz atalım; birçokları tarafından Rudolf Virchow patoloji tarihinin en önemli ismi olarak görülmektedir. Erken eğitimini doğa bilimlerinin temel konularına ilgisinin geliştiği Berlin’de aldı. 1843’te onu uzun yıllar meşgul edecek inflamasyon konusu üzerine tez vererek mezun oldu. Mezuniyeti sonrası mikroskopi ve analitik kimya gibi ileri görüş gerektiren iki konu üzerinde çalıştı. 1846’da ilk kez basılan “Berlin Journal of Experimental Pathology” Virchow’un ilk yayınlarını da içermekteydi. Bu derginin sadece iki sayısının çıkartılabilmesi elinde hızla veri birikmiş olan Virchow’u kendi dergisini çıkarmaya itti. Bu, kayda değer bir hareketti. İlgi gören dergi patolojik anatominin lider dergisi oldu. Dergi “Virchow’un Arşivi” olarak bilinir. Robert Koch tüberküloz basilini ve daha pek çok bakteriyi keşfetti. Tüberküloz basilinin histolojik olarak gösterilmesinde de kısmen rolü bulunmaktadır. Hiç şüphesiz aslında kuzeni olan Weigert’le aynı laboratuvarda çalışan Paul Ehrlich kimyasal ve deneysel patoloji ve bunlarla ilgili diğer disiplinlerin lider savunucusu olmuştur. Weigert’in ayırıcı boyama teorisinden yola çıkarak, boyanma özellikleri dikkate alındığında değişik tipte lökositlerin ayırt edilmesini sağlayan yeni ve önemli birkaç bilimsel çalışmayı desteklemeye yetecek güçte bir vakıf kurdu. Kan dokusu üzerindeki çalışmaları ve keşifleri günümüzde anemi ve lösemiyle ilgili alanlarda ayırıcı tanının temelini oluşturdu. Daha önce de belirtildiği üzere anilin boyalarının keşfi histolojik boyanmaları büyük ölçüde geliştirdi. Bu alanda pek az kişi anilin boyaların bazılarıyla canlı dokuların da güvenle boyanabileceğini gösteren Paul Ehrlich kadar önemli bir rol oynamıştır. 1847’de Joseph Garleck, dokuların içindeki damarlara amonyaklı karmen jelatin enjekte etti. Kazara alkalin karmenin çekirdek tarafından artmış affiniteyle tutulduğunu keşfetti. Bu, ilk çekirdek boyasıydı. Enzim histokimyasının gelişimi, 60’ların sonunda gösterilebilir enzimlerin sayısının 75’e kadar çıkması ve bugün bu Carl Weigert doku rejenerasyonu ve nekrozunu anlama yolunda adım attı. Çalış- 4 A.Ü. Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji ABD web sayfası sayının 100’ü aşması dikkate alındığında anlaşılabilir. Günümüzde enzim histokimyası tanıda kısıtlı role sahiptir ve yerini daha kesin sonuçlara ulaşabilen bir disiplin olan immünhistokimyaya bırakmıştır. İmmünhistokimya çalışmalarının uygulanabilme olasılığı 1941’de Coons ve arkadaşlarının spesifik bir antikoru flüoresan bir boyayla boyamalarıyla ortaya çıkmıştır. Patologlar immünflüoresan yöntemlerini tanıda kullanma konusunda yavaş davrandılar. Bu yöntemin etkinliği 60’ların ortalarına kadar dikkate alınmadı. Bu tarihten sonra ise bu konuyla ilgili araştırmalarda bir patlama yaşandı. Bugün kullandığımız immünopatoloji bir dereceye kadar immünflüoresan yöntemlerinin başarı kazanmasının üzerine kurulmuştur. Özellikle renal hastalıklar, cilt hastalıkları ve otoimmün hastalıklarda tanısal uygulamalar hızla bu gelişmeleri izledi. Paradoksik olarak immünflüoresan yöntemlerin kullanımındaki başarı, bu yöntemde kullanılan flüoresan bağlı antikorların bazı dezavantajlarından kaçınmak için alternatif bir tekniğin oluşturulmasındaki gereği doğurdu. İmmünperoksidaz yöntemleri bu problemlerin bir kısmını yenmek için geliştirildi. Spesifik bir antikorun flüoresan izotiyosiyanat yerine bayırturbu (horseradish) peroksidazıyla konjugasyonu ilk basamaktı. Bu peroksidaz, belirteç enzimi olarak seçilmişti ve enzim-antikor lokasyonunda kararlı bir renk reaksiyonu üretebiliyordu. Parafin blokların kullanımı, hücre tanımlanması için gerekli spesifik immünolojik kriterlerin karşılaştırılabileceği mükemmel morfolojik ayrıntılar verdi. 1975’te monoklonal antikorların gelişimi histolojide devrim yarattı. Poliklonal antikorların üretilemediği birçok antijene karşı monoklonal antikorlar geliştirildi. Bunun yanı sıra kullanımdan kullanıma değişiklik gösteren poliklonal antikorların aksine monoklonal olanlarda standardizasyon mümkün oldu. Elde edilebilen monoklonal antikorların çeşitliliği sadece tek bir veya bir grup hücrenin karakterize edilimesine değil aynı zamanda bu hücrelerin fonksiyonel durumunu da izlemeye olanak sağlamaktadır. Örneğin monoklonal bir antikor olan Ki67, bir hücrenin siklusun dinlenme fazında olup olmadığının analiz edilmesine olanak sağlar. Meme karsinomu hücrelerinin östrojen reseptör durumu da monoklonal antikorlar kullanılarak analiz edilebilir. Monoklonal antikorlar tarafından tanınan antijenlerin geniş spektrumu nedeniyle bazılarının zorlukla görüntülenecek nitelikte olması kaçınılmazdır. Bu problemi yenmek için daha gelişmiş ve duyarlı tanı sistemleri geliştirilmiştir. Bu sistemlerin kullanımı daha önce tespit edilemeyen antijenlerin görüntülenmesini sağlamıştır. Moleküler biyologların belirli bazı genleri klonlama çabaları yeni ve heyecan verici bazı antijenlere karşı monoklonal antikor üretimine izin vermiş bulunmaktadır. İmmünhistokimya alanındaki heyecan verici gelişmeler patolojik olayların temelini anlama yolunu açmaktadır. İlk immünperoksidaz konjügatları bunlara karşılık gelen immünflüoresan konjugatlara göre biraz daha iyiydiler. Bunların rutin işlem görmüş dokulara uygulanması bu yöntemin araştırma ve tanı amaçlı kullanımında önemli bir adım oldu. İlk kez bir yöntem antijenlerin gösterilmesine olanak sağlıyordu ve böylece patologların immünolojik bulguları geleneksel sitolojik ve histolojik kriterlerle karşılaştırması olanaklı kılındı. Bu gelişmelerin histopatolojideki etkileri hızlıydı ve günümüzde rutin olarak kullanılan belli sayıda teknikte bu etkiler izlenmektedir. Araştırmacı patolojide immünsitokimya teknikleri belirli bir yer edindi. Histolojideki fonksiyonel gelişmeler hücre yapısındaki değişiklilere bağlı olarak ortaya çıkan hücre anormalliklerinin artmasıyla ilgi çekmiştir. Son yüzyılın gelişmeleri artık boyama ile ilgili değildir. 1950’lerde kriyostatın keşfi enzim histokimyasının gelişmesini sağlamıştır, ancak histokimyasal teknikler enzimler için 5 A.Ü. Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji ABD web sayfası tek yöntem değildir. Artık bir çok doku komponenti bilimsel temeli iyi anlaşılmış kimyasal reaksiyonlarla gösterilebilmektedir. İmmünhistokimyayı da içeren histokimyadan elde edilen kimyasal tepkimelere ilişkin bilgiler elektron mikroskobuyla gösterilen hücresel komponentler hakkındaki bilgileri tamamlamıştır. Histokimyanın ulaşabileceği noktalar sınırsız olabilir, ancak bu tekniklerin de dezavantajları bulunmaktadır. Taze dokuyla çalışma gereği, son tepkime ürünlerinin yumuşak renkleri, kalıcı preparasyonlardaki sorunlar hâlâ arzulanan birşeyler bırakmaktadır. Histologlar spesifik aktif yapıları tanımlamak gereğini duymaktadırlar. Moleküler patoloji, in situ hibridizasyon, genetik değişimler ve immünhistokimyadaki gelişmeler bizi bu amaçlara ulaştırabilir. Histopatolojide belirteçlerin özgünlüğü arttıkça histokimyasal yöntemler artmaktadır. Daha önce de özetlediğim gibi tanımlama ve büyütme artık histolojide problem olarak görülmemektedir. Bugün, histolojik yapıları gözlemleyebiliyor ve normal ve anormal fonksiyonları tanıyabiliyoruz. 40 yıl önce hayal bile edemediğimiz duyarlılığa ve özgünlüğe artık erişebiliyoruz. Elektron mikroskobu, enzim ve immünsitokimya tekniklerinin rutin boyama teknikleriyle birleştirilmesi artık hepimiz tarafından kabul edilmektedir. Yeni yöntemlerin bazıları vücut sıvılarını incelemek amacıyla kimyacılar ve immünologlar tarafından da kullanılsa da histopatoloji, dokulardaki hücrelerdeki işlev anormalliklerini tanımlamak amacıyla kullanıldığında yeri doldurulamaz. Sayısı giderek artan yöntemlerimizi artan patolojik problemler üzerinde uygulamayı sürdürmeliyiz. Geçmişteki büyük bilim adamlarının sağladığı katkılara benzer biçimde şu anda kullandığımız tekniklerin yeni bilgiler getireceği ve katkılar sağlayacağı olasıdır. 6