S10-Farelerde Orta Serebral Arter Tıkanıklığına Bağlı Gelişen
Transkript
S10-Farelerde Orta Serebral Arter Tıkanıklığına Bağlı Gelişen
FARELERDE İNTRAPERİTONEAL UYGULANAN OZON TERAPİNİN ORTA SEREBRAL ARTER TIKANIKLIĞINA BAĞLI GELİŞEN ENFARKT ALANI ÜZERİNE ETKİLERİ Gonca AŞUT, Tayfun BAYRAKTAR, Merve Naz İNAN, Saniye Gökçe SAYKAL, Cemre Gül TEKİN, Aykut UÇAR Danışman: Yrd. Doç. Dr. Tolga Reşat AYDOS ÖZET Çalışmamızda oksidatif mekanizmalar üzerinden etkili olduğu kabul edilen ozon terapinin, topikal FeCl3 uygulamasıyla orta serebral arterde (OSA) oluşturulan oklüzyon sonucu gelişen iskemi üzerindeki olası etkileri araştırıldı. 24 yetişkin erkek Swiss albino fare rastgele olarak dört gruba ayrıldı. Sham Grubu’na herhangi bir uygulama yapılmadı. FeCl3 Grubu, OSA üzerine % 30’luk FeCl3 solüsyonu uygulandı. Ozon Grubu, 5 gün boyunca gün aşırı i.p. ozon (0,7 mg/kg/gün) uygulandı. Ozon-FeCl3 Grubu, 5 gün boyunca gün aşırı i.p. ozon uygulamasını takiben FeCl3 uygulandı. Sham (n=5) ve ozon (n=3) gruplarından elde edilen kesitlerde enfarkt alanına rastlanmadı. FeCl3 (n=6) ve ozon-FeCl3 (n=4) gruplarından elde edilen kesitlerde ise enfarkt oluşumu saptandı. FeCl3 grubunda enfarkt alanlarının ortalaması 7,8±2 mm2 ve ozon-FeCl3 grubunda 5,8±0,8 mm2 olarak hesaplandı. Her iki gruptaki enfarkt alanlarının istatistiksel değerlendirilmesinde anlamlı bir fark tespit edilmedi. Bu bulgular ışığında, farelere intraperitoneal uygulanan ozon terapinin, OSA tıkanıklığına bağlı gelişen enfarkt alanı üzerine etkisinin olmadığı sonucuna ulaşıldı. Anahtar kelimeler: Ozon terapi, fare, iskemi, orta serebral arter, FeCl3 GİRİŞ İskemi; kan damarının daralması veya obstrüksiyonu sonucu dokunun kanlanmasının ortadan kalkması veya çok azalmasıdır. İskemiye bağlı gelişen felçlerin ana nedenleri emboli, hemoraji, yüksek tansiyon ve arteriovenöz bozukluklardır(5). Tüm organlarda iskemi görülmesine rağmen iskemiden en sık etkilenen organlar kalp ve beyindir(10). Beyin iskemilerinin büyük bir kısmının ve tüm iskemiye bağlı felçlerin % 15-30’unun nedeni OSA tıkanıklığıdır(12,13). Erkeklerde OSA tıkanıklığı bayanlardan 2 kat fazla görülmektedir. OSA tıkanıklığına bağlı gelişen felçler ilerleyen yaşlarda artmaktadır(14). İskemik tromboembolik inme profilaksisinde yaygın olarak aspirin, tPA, klopidogrel ve tiklopidin kullanılmaktadır(8). Profilakside kullanılan antitrombositik ajanlar siklooksijenaz (COX) sistemini inhibe ederek güçlü bir trombosit aktivatörü olan tromboksan A2 seviyesini azaltırlar ve bu mekanizma üzerinden etki gösterirler. Çalışmamızda OSA tıkanıklığına bağlı gelişen enfarkt alanının küçültülmesinde i.p. uygulanan ozonun etkileri incelenmiştir. Deneysel OSA tıkanıklığı, çeşitli çalışmalarda “ip” ile OSA’nın bağlanması, mikroklip ile OSA’nın tıkanması, elektrokoagülasyon, endotelin-1 ile OSA oklüzyonu, mikroemboli ile OSA oklüzyonu, lazer aracılı fotokoagülasyon ile OSA oklüzyonu metodları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmamızda ise Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalından Dr. Hülya Karataş-Kurşun ve Doç. Dr. Yasemin Gürsoy-Özdemir’in çalışmalarında kullandıkları topikal FeCl3 uygulamasıyla OSA oklüzyonu modeli tercih edilmiştir(11). Topikal FeCl3 uygulaması, damarın median intiması ve endotele geçerek demir aracılı kimyasal oksidasyona bağlı endotel hasarı oluşturur. Gelişen hasar sonucunda bu bölgede platelet adezyonu ve agregasyonu meydana gelir. Koagülasyon kaskadının aktive olması sonucu fibrin depolanması ile trombüs oluşur(16). Karotid arterde % 2,5 gibi düşük dozlarda tam oklüzyon sağlanabilmesine rağmen, OSA’nın karotid artere göre daha periferde olması, damarların farklı fizyolojik ve anatomik yapıları ve OSA üzerindeki intakt duramater nedeniyle FeCl3 daha yüksek dozlarda tam oklüzyon gerçekleştirebilmektedir(11). Ozon, biyolojik sıvılarda çözünmüş olan organik ve inorganik moleküllerle özellikle poliansatüre yağ asitleri, askorbik asit gibi antioksidanlar, sistein gibi sülfidril grubu içeren tiyol bileşikleri, redükte glutatyon (GSH) ve albumin- ile çok kısa sürede tepkimeye girer(2,4). Ozonun organik ve inorganik maddelerle girdiği bu tepkimeler süperoksit, hidrojen peroksit ve hipoklorik asit gibi pek çok serbest oksijen radikalinin oluşumuna yol açar(2). Ozon oluşturduğu bu serbest oksijen radikalleri ile çeşitli fizyolojik cevapların doğmasına neden olur. Eritrositlerde 2,3-difosfogliserat (2,3DPG) miktarını artırır ve hemoglobin-oksijen ayrışma eğrisini sağa kaydırır(4). Böylece eritrositler oksijeni dokulara daha kolay bırakırlar. Nitrik oksit (NO) salıverilmesini artırarak vazodilatasyona dolayısıyla da dokuların kan akımında artışa yol açar(15). Dokulara kan akımını artırması nedeniyle genel olarak metabolizmayı artırır. Serbest oksijen radikallerinin artması antioksidan enzim seviyelerinde ve bağışıklık sisteminin aktivitesinde değişikliğe yol açar. Lökosit ve endotel hücrelerinde interferon, interlökin ve büyüme faktörlerinin yapımını indükler(3,6). Ozon tedavisi bu etkileri nedeniyle inflamatuar sürecin yoğun olduğu ve bağışıklık sisteminin tetiklendiği fizyopatolojik durumlarda tedavi amacıyla kullanılabilmektedir. Enfeksiyonlar, arteriyel dolaşım bozuklukları, senil maküler dejenerasyon, akciğer, bağırsak, dişeti, deri ve eklem hastalıklarında ozon tedavisinin uygulandığı görülmektedir(9). Ayrıca iskemik hastalıklar, diyabet, immünosupresyon ve malnütrisyona bağlı oluşabilecek kronik ülserlerin tedavisinde de ozonun faydalı olabileceği düşünülmektedir(1). Çalışmamızda farelerde topikal FeCl3 uygulamasıyla oluşturulan OSA tıkanıklığı modelinde(11), i.p. uygulanan ozon terapinin, meydana gelen enfarkt alanı üzerine etkileri araştırılmıştır. GEREÇ ve YÖNTEM Bu çalışma Başkent Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından onaylanmış (Proje no:DA11/10) ve Başkent Üniversitesi Araştırma Fonunca desteklenmiştir. Çalışmamızda 40,05±4,57 g ağırlığında 24 yetişkin erkek Swiss albino fare kullanıldı. Araştırma Ünitesinde fareler sıcaklığı (25±20C) ve bağıl nemi (%32±7) sabit, havalandırma (vantilatör ile) kontrollü, 12 saat aydınlık/karanlık döngüsü uygulanan ortamda standart fare kafeslerinde barındırıldı. Yem ve su kısıtlaması yapılmadı. Her biri rastgele seçilmiş 6 fareden oluşan 4 grup üzerinde çalışma yürütüldü. Tüm gruplarda ketamin/ksilazin anestezisi (150/9 mg/kg, i.p.) uygulanan fareler yüz üstü pozisyonda dış kulak yollarından ve burundan sabitlenecek şekilde stereotaksi çerçevesine yerleştirildi (Şekil 1). Şekil 1. Farelerin yüz üstü pozisyonda dış kulak yollarından ve burundan sabitlenecek şekilde stereotaksi çerçevesine yerleştirilerek cerrahi işleme başlanması. Sağ lateral epikantus ve sağ dış kulak yolu arasındaki hattın ortasından dik olarak cilt kesisi yapıldı. Temporal kas, temporal kemiğin skuamöz parçası görülene kadar sıyrıldı. Kemik yapı serum fizyolojik ile ıslatılarak altındaki distal OSA’nın seyri gözlendi. OSA’nın seyri anlaşıldıktan sonra dakikada 40.000 devir ile çalışan matkap (Nouvag AG, Germany) yardımıyla zigomatik ark ve skuamöz parçanın anterior bileşkesinin 2 mm üzerinde kemik inceltilmeye başlandı. İnceltme süresince aralıklarla soğuk serum fizyolojik uygulanarak kemik soğutuldu. İnceltilen kemik, OSA ve onu örten duramater parçasına zarar vermeden uzaklaştırılarak bir pencere açıldı. Cerrahi işlemler sırasında x50 büyütmede mikroskopla (Zeiss, Germany) çalışılırken OSA’yı daha rahat görebilmek için farelerin sabitlendiği stereotaksi çerçevesi horizontal düzlemle 45°’lik açı yapacak şekilde yan yatırılmıştır. Bu esnada ön ve arka ekstremitelerinden sabitlenmesine rağmen karın bölgesinin sarkmasına bağlı farelerde dolaşım ve solunum problemi yaşanmaması amacıyla karın bölgesi bir tamponla desteklenmiştir. Deney grupları: Sham Grubu: Pencere açıldıktan sonra herhangi bir uygulama yapılmadan kafa derisi dikişle kapatıldı. Dikiş yapılan bölge oksitetrasiklimtetraklorür içeren sprey (Neocof®) ile dezenfekte edildi. FeCl3 Grubu: Pencere açılarak OSA ortaya çıkartıldıktan sonra, OSA üzerine % 30’luk FeCl3 solüsyonu emdirilmiş filtre kâğıdı yerleştirildi, 1012 dakika bekleme sonrası filtre kâğıdı uzaklaştırılıp, trombüs oluşumuna bağlı kan akışının kesilmesi mikroskop altında gözlendikten sonra kafa derisi dikişle kapatıldı. Ozon Grubu: Beş gün boyunca gün aşırı i.p. ozon (0,7 mg/kg/gün) uygulamasını takiben farelerin kafatasında pencere açılarak ve herhangi bir uygulama yapılmadan kafa derisi dikişle kapatıldı. Ozon-FeCl3 Grubu: Beş gün boyunca gün aşırı i.p. ozon uygulamasını takiben farelerin kafatasında pencere açılarak OSA ortaya çıkartıldıktan sonra, OSA üzerine % 30’luk FeCl3 solüsyonu emdirilmiş filtre kâğıdı yerleştirildi. 10-12 dakika bekleme sonrası filtre kâğıdı uzaklaştırılıp, trombüs oluşumuna bağlı kan akışının kesilmesi gözlendikten sonra kafa derisi dikişle kapatıldı. Tüm gruplarda fareler cerrahi işlemlerin tamamlanmasından 24 saat sonra yüksek doz anestezi (ketamin-ksilazin) altında dekapite edilip beyinleri çıkarıldı. On dakika buz soğukluğundaki % 0,9’luk izotonik NaCl çözeltisinde bekletilen beyinlerden tasarımı tarafımızca gerçekleştirilen aletle (Şekil 2) 2 mm aralıklarla 5 koronal kesit alındı. Şekil 2. Fare beyinlerinden 2 mm aralıklarla kesit alınması için geliştirilen alet. Kesitler, karanlık ortamda 40 dakika (homojen boyanmanın gerçekleşebilmesi için 20. Dakikanın sonunda kesitlerin diğer yüzü çevrildi) % 2’lik 2,3,5, trifenil tetrazolium klorid monohidrat (TTC) çözeltisinde bekletildi. Kesitler lam üzerine alınarak fotoğrafları çekildi (Kodak Easyshare C190, 12.3 MP). TTC’nin, yaşayan mitokondriler tarafından alınıp mitokondriyal solunum zincirinde yer alan dehidrogenazlar tarafından indirgenmesi hızla çıkartılan beyin kesitlerinde enfarktlı dokunun normal dokudan renk farkı yardımı ile ayırt edilmesine olanak sağladı. Çekilen fotoğraflardaki enfarkt alanları Image J® programında hesaplandı. Elde edilen veriler (ortalama±ortalamanın standart hatası) Student’s t testi ile değerlendirildi. BULGULAR Kesit fotoğrafları üzerinde yapılan inceleme sonucunda sham (n=5) ve ozon (n=3) gruplarından elde edilen beyin kesitlerinde herhangi bir enfarkt alanına rastlanmadı (Şekil 3-A ve B). FeCl3 ve ozon-FeCl3 gruplarından elde edilen kesitlerde ise OSA’da gerçekleştirilen oklüzyonun beyin dokularında enfarkt alanı oluşumuna yol açtığı saptandı. FeCl3 grubunda (n=6) enfarkt alanlarının ortalaması 7,8±2 mm2 ve ozon-FeCl3 grubunda (n=4) ise 5,8±0,8 mm2 olarak hesaplandı (Şekil 3-C ve D; Şekil 4). Her iki gruptaki enfarkt alanlarının istatistiksel değerlendirilmesinde anlamlı bir fark tespit edilmedi. Şekil 3. A)Sham B)FeCl3 C)Ozon D)Ozon-FeCl3 deney gruplarına ait TTC boyaması yapılmış beyin kesitleri. Şekil 4. Deney gruplarına ait beyin dokularında tespit edilen enfarkt alan ölçümleri (Ortalama±OSH). TARTIŞMA Çalışmamızda, farelerde topikal FeCl3 uygulaması ile gerçekleştirilen OSA tıkanıklığı sonucu oluşan enfarkt alanına, i.p. uygulanan ozon terapinin etkileri incelendi. Sham ve ozon gruplarında enfarkt alanı tespit edilmezken, FeCl3 ve ozon- FeCl3 gruplarında enfarkt alanlarının oluştuğu gözlemlendi. Ancak oluşan enfarkt alanları arasında anlamlı bir fark bulunamadı. Ozon terapi günümüzde otohemoterapi, intraperitoneal, intramüsküler, rektal ve vaginal insüflasyon, ozonlu su, ozon enjeksiyonu yöntemleri ile uygulanmaktadır. Yapılan araştırmalarda böbrek iskemik hasarında(14) uygulanan ozon terapi, süperoksit dismutaz (SOD) enziminin derişimini artırarak reaktif oksijen moleküllerinin (ROM) toksititesini azaltmıştır. Ayrıca iskemi sonrası endotelin-1’i baskılayarak böbrek kan akımını artırmaktadır. Ancak, çalışmamızda beyindeki enfarkt alanına ozon terapinin istatistiksel olarak anlamlı bir etkisi bulunmamıştır(7). Bu sonuç, çalışmamızda ozonun intraperitoneal yolla verilmesi ve/veya ozonun muhtemel etkilerini beyinde gerçekleştirememesinden kaynaklanabilir. Dokulardaki iskemik hasar üzerine ozon terapinin olumlu etkilerinin gösterildiği çalışmalarda deney hayvanı olarak sıçanlar kullanılmıştır. Çalışmamızda sıçan yerine farelerin kullanılması, deney gruplarımızdaki hayvan sayılarının azlığı gibi etmenler de sonuçlar üzerine etki göstermiş olabilir. Sonuç olarak, i.p. uygulanan ozonun OSA tıkanıklığına bağlı beyin iskemisinde herhangi bir etkisi gözlenmemiştir. Yukarıda tartışılan etmenler göz önünde bulundurularak planlanacak yeni bir deney düzeneği ile beyin iskemisi üzerine ozon tedavisi etkileri daha net olarak ortaya konulabilir. (*) Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji Anabilim Dalından Dr. Hülya Karataş-Kurşun ve Doç. Dr. Yasemin Gürsoy-Özdemir’e çalışmamıza verdikleri destekten dolayı teşekkürlerimizi sunarız. KAYNAKLAR 1. Bocci, V.A.: Ozone.A New Medical Drug, 2nd Ed, Springer, New York City, NY,USA; 2005 2. Bocci VA. Scientific and Mediacal Aspects of Ozone Therapy. State of Art. Archives of medical research 2006; 37:425-435 3. Bocci VA, Paulesu L. Studies on the biological effects of ozon: Introduction of interferon gamma on human leucocytes. Haematologica 1990; 75:510-515 4. Bocci VA, Borelli E, Travagli V, et al. The Ozone Paradox:Ozone is a Strong Oxidant as well as a Medical Drug. Medicinal Reserch Reviews 2009; 29:646682 5. Caplan LR. Dissections Neurol. 2008; 4:34-42. of brain-supplying arteries. Nat Clin Pract 6. Di Paolo N, Bocci V, Gaggiotti E. Ozone Therapy. Int. J Artif Organs 2004; 27:168-175 7. Barber E, Mene’ndez S, Leo’n OS, et al. Prevention of renal injury after induction of ozone tolerance in rats submitted to warm ischaemia. Mediators of Inflammation 1999; 8:37–41 8. Gustafsson D, Elg M. The pharmacodynamics and pharmacokinetics of the oral direct thrombin inhibitor ximelagatran and its active metabolite melagatran. Thromb Res. 2003; 109:9-15. 9. Gürel E. Ozone Therapy In Medicine. Sağlıklı Yaşam Tarzı Dergisi 2009; 1:92101 10.Johansen D, Ytrehus K, Baxter G. Exogenous hydrogen sulfide (H2S) protects against regional myocardial ischemia–reperfusion injury. Basic Research in Cardiology 2006; 10:53-60. 11.Karatas H, Erdener S, Gursoy-Ozdemir Y, et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl3 application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 2011:8 12.Karpiak SE, Tagliava A, Wakade C. Animal Models for the study of drugs in ischaemic stroke. Ann.Rev.Pharmac. Tox. 1989; 29:403-414 13.Mohr JP, Gautier JC, Hier D, et al. Middle Cerebral Artery. Stroke 1986; 377450 14.Moulin T, Tatu L, Vuillier F, et al. Role of a stroke data bank in evaluating cerebral infarction subtypes: patterns and outcome of 1,776 consecutive patients from the Besancon stroke registry. Cerebrovasc Dis. 2000; 10:26171. 15.Vallacchi G, Bocci VA. Studies on the biological effects of ozon: Release of factors from human endothelial cells mediators inflammation. 2000; 9:271276 16.Wang X, Xu L. An optimized murine model of ferric chloride-induced arterial thrombosis for thrombosis research. Thromb Res. 2005; 115:95-100