safen ven hazırlanmasında serum fizyolojik ve laktatlı ringer
Transkript
safen ven hazırlanmasında serum fizyolojik ve laktatlı ringer
T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ KALP DAMAR CERRAHİSİ ANABİLİM DALI Tez Yöneticisi Prof. Dr. Mutasım SÜNGÜN SAFEN VEN HAZIRLANMASINDA SERUM FİZYOLOJİK VE LAKTATLI RİNGER SOLÜSYONU KULLANIMININ ENDOTEL HASARI ÜZERİNE ETKİSİ (Uzmanlık Tezi) Dr. Muhammet Murat CANTÜRK EDİRNE - 2011 1 TEŞEKKÜR Eğitimimiz için; çağdaş, özgür ve bilimsel çalışma ortamı hazırlamak amacıyla fedakarlıktan kaçınmayan, sağladığı olanaklarla uzmanlık eğitimimizi başarıyla sürdürmemizi sağlayan, mesleki bilgi, deneyimimizde yardımlarını esirgemeyen, bize cerrahi sanatını öğreten değerli hocalarım Rektörümüz Sayın Prof. Dr. Enver DURAN ve Dekanımız Sayın Prof. Dr. Murat DİKMENGİL’e, tez danışmanım ve Anabilim Dalı başkanımız Sayın Prof. Dr. Mutasım SÜNGÜN hocama, Histoloji Anabilim Dalında Sayın Prof. Dr. Mehmet KANTER’e, Uzm. Biyolog Mustafa ERBOĞA’ya, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakütesi Biyokimya Anabilim Dalında Sayın Prof. Dr. Hafize UZUN’a, Arş. Gör. Hayriye ERMAN’a, Hocalarım Sayın Prof. Dr. Suat CANBAZ’a ve Sayın Prof. Dr. Turan EGE’ye, diğer hocalarıma ve tüm arkadaşlarıma teşekkür ederim. 2 İÇİNDEKİLER GİRİŞ VE AMAÇ............................................................................................................. 1 GENEL BİLGİLER......................................................................................................... 4 KORONER ARTER BYPASS CERRAHİSİ .......................................................... 4 BÜYÜK VE KÜÇÜK SAFEN VEN ......................................................................... 7 VENLERİN MORFOLOJİK VE HİSTOLOJİK YAPISI .................................. 10 VASKÜLER ENDOTELYAL HÜCRELER ........................................................ 13 TROMBOZİS ........................................................................................................... 16 İNTİMAL HİPERPLAZİ ....................................................................................... 17 ATEROSKLEROZİS .............................................................................................. 17 NİTRİK OKSİT ....................................................................................................... 18 CD34 ( ENDOTEL PROGENİTÖR HÜCRELER) ............................................. 21 APOPTOZİS ............................................................................................................ 22 REAKTİF OKSİJEN TÜRLERİ (SERBEST OKSİJEN RADİKALLERİ) ..... 23 HEPARİN ................................................................................................................. 25 GEREÇ VE YÖNTEMLER ....................................................................................... 26 BULGULAR ..................................................................................................................... 32 TARTIŞMA ...................................................................................................................... 48 SONUÇLAR ..................................................................................................................... 57 ÖZET .................................................................................................................................. 59 SUMMARY ...................................................................................................................... 61 KAYNAKLAR................................................................................................................. 63 EKLER 3 SİMGE VE KISALTMALAR AT Ca +2 : Anjiotensin : Kalsiyum CD34 : Endotel progenitör hücreler cGMP : Siklik Guanosin 5-Monofosfat E-1 : Endotelin-1 ED : Endotel disfonksiyonu EDRF : Endothelium derived relaxing factor eNOS : Endoteliyal nitrik oksit sentaz EPH : Endotelyal progenitör hücreler ET : Endotelin HE : Hematoksilen eozin İTA : İnternal torasik arter İÜCTF : İstanbul üniversitesi cerrahpaşa tıp fakültesi KABG : Koroner arter bypass greft KAT : Katalaz L-NMMA : NG-nitro-monometil-l-arginin LR : Laktatlı ringer MDA : Malondialdehit nNOS : Nöronal nitrik oksit sentaz NO : Nitrik oksit NOS : Nitrik oksit sentaz PG : Prostaglandin 4 RA : Radial arter ROT : Reaktif oksijen türevleri SF : Serum fizyolojik SOD : Süperoksit dismütaz TA : Tunika adventisya Tİ : Tunika intima TM : Tunika media TÜTF : Trakya üniversitesi tıp fakültesi VEBF : Vasküler endotelyal büyüme faktörü VSM : Vena safena magna VSP : Vena safena parva 5 GİRİŞ VE AMAÇ Kalp cerrahisi günümüzde tüm dünyada sıklıkla uygulanan bir cerrahi yöntem olarak literatürde yer almaktadır (1-3). Koroner arter bypass greft operasyonu (KABG), gelişmiş ülkelerde yapılan en sık majör operasyondur ve tüm dünyada her yıl yaklaşık 1 milyon hastaya yapılmaktadır (4). İskemik kalp hastalıklarına yönelik ilk cerrahi girişimler 1930’lu yıllara dayanmaktadır (1). 1937 yılında Kalp akciğer makinesinin Gibbon tarafından keşfi bugün ki kalp cerrahisinin gelişiminde büyük önem taşımaktadır. 1968 yılında Favoloro vena safena magna (VSM) kullanarak aortokoroner bypass ameliyatlarını yayınlamış ve sonrasında VSM yaygın kullanım alanı bulmuştur (5). Koroner arter hastalığında miyokardın revaskülarizasyonu için cerrahi tedavi en etkili ve uzun süreli bir çözümdür (1). Cerrahi sonuçlar kısa ve orta dönemde iyi iken uzun dönemde greft yetmezliği ile etkilenmektedir (6). Aortokoroner bypass greftlerinin cerrahi girişim sonrası ilk 3 ayda tıkanma hızları %7-12, birinci yılda %10-20 arasındadır ve yıllık %2-5 oranında ilerler. Beşinci yılda Aortokoroner greftlerin %25’i, onuncu yılda ise %35’i tıkanır (7). En sık kullanılan greftler, büyük safen ven (SV), internal torasik arter (İTA) ve radial arter (RA)’dir. SV hızla çıkarılabilmesi, hazırlanmasının kolay olması, mükemmel bir akım sağlayabilmesi ve spazm olmaması gibi özelliklerinden dolayı koroner arter bypass cerrahisinin ilk gününden beri kullanılmaktadır. Safen ven çıkarıldıktan sonra dışarda bekleme süresine ve bekletildiği solüsyon seçimine dikkat edilmelidir. Ven duvarında oluşabilecek hasar, intimal hiperplazi gelişimine yol açarak greftin erken dönemde stenozuna neden olan en önemli faktördür (8-10). Endotel hasarı greft başarısızlığında en büyük neden gibi görünmektedir. Bu hasar venin cerrahi olarak çıkartılması sırasında yapılan aşırı germe, 1 kaba cerrahi travma, uygunsuz solüsyonlarla bekletme veya anastomoz öncesi vücut dışında uzun süre bekletmeye bağlı serbest oksijen radikalleri ve iskemiye bağlı olarak ortaya çıkar. Erken, orta ve geç dönem olmak üzere 3 tip greft başarısızlığı mevcuttur. Erken greft başarısızlığı operasyondan ilk 30 gün içerisinde görülür. Hızlı greft trombozu olur. Orta dönem greft başarısızlığı özellikle anastomoz bölgesinde ve greft duvarında ilk iki yıl içinde görülen fibröz hiperplazi nedeniyle ortaya çıkar. Geç dönem greft başarısızlığı ise beş yıldan sonra ven greftlerinde, hızlanmış ateroskleroz gelişmesine bağlıdır. Endotel hasarına ek olarak kardiyopulmoner bypass’a bağlı gelişen trombosit aktivasyonu ve hiperkoagulabilite ve kan akımında oluşabilecek staz diğer greft başarısızlığında önemli faktörlerdir (11). Endotel kaybı luminal yüzde fibrin birikimine neden olur, erken greft açıklığını azaltan faktörlerden olan plateletler ve nötrofiller ortamda artar, doku plazminojen aktivatör üretimi azalır (12). Endotel kaybı eksojen koagülasyon kaskatını aktive ederek trombozu başlatır. İntimal hiperplazi, düz kas hücreleri ve ekstrasellüler matriksin intimal kompartmanda birikmesi olarak tanımlanabilir ve implante ven greftlerinde ilk 1 ay-2 yıllık dönemde gelişen majör greft hastalığıdır. Koroner arter bypass cerrahisinden sonraki birinci yıldan itibaren iskemik belirtilerin yeniden ortaya çıkması ve safen vende oluşan zayıflamanın temel nedeni aterosklerozistir. Ancak bypass cerrahisinden sonra gelişen miyokard iskemilerinde %70-85 olguda suçlu lezyon, trombüsle yüklenmiş ven greft aterosklerozisidir (13). Fonksiyonları bozulmuş bir endotelin başlıca belirtilerinden biri, biyolojik açıdan yararlanılabilir nitrik oksit (NO) düzeylerinin düşük oluşudur. Bu, NO sentezindeki bir düşme ya da lokal olarak reaktif oksijen türevlerinin (ROT) yapımının artışına bağlı NO inaktivasyonundaki bir artışın sonucu olarak ortaya çıkabilir. Uzayan iskemi sonucunda bozulmuş endotel fonksiyonu, endotel bağımlı vazodilatasyonun baskılanması ve vasküler adezyonun artması ile ilişkilidir (14). Hücre kültürleri ve hayvan çalışmaları; Endotelyal Progenitör Hücreler (EPH)’nin, endotel disfonksiyonu (ED) ve ateroskleroz gelişiminde koruyucu rol oynadığını düşündürmektedir. Bu hücrelerin insan üzerindeki patofizyolojik rolü çok açık değildir (15). Prematür EPH’lerin, iskemik olaylardan sonraki anjiyogenezin yanında doku yenilenmesinde de etkili olduğu gösterilmiştir. Son dönemde yapılan çalışmalarda dolaşan EPH’nin; statin, östrojen veya egzersiz ile sayısının arttırılmasının vasküler hasar sonrası reendotelizasyonu iyileştirebileceği öne sürülmüştür (16,17). Oluşan endotel hasarı sonucu oksidan-antioksidan dengenin, oksidan lehine bozulması durumunda, oksidatif hasardan söz edilebilir. Oksidatif hasar, superoksitten kaynaklanan 2 serbest radikaller ile NO’in reaktif türlerinin neden olduğu hasarların toplamıdır (18). Süperoksit radikallerinin oluşması; membran lipid ve proteinlerinin yapısını bozarak hücre fonksiyonunu engellemekte, çekirdek membranını hasarlayarak DNA’yı kırılma ve mutasyonlara açık hale getirmektedir. Bu şekilde hücre fonksiyon bozukluğu ve/veya ölümüne neden olmaktadır. Süperoksit, süperoksit dismutaz (SOD) tarafından peroksidlere çevrilir. Dismutasyon reaksiyonun ürünü hidrojen peroksiddir. Katalaz ve gulutatyon peroksidaz tarafından parçalanır (19). İskemiye uğramış ve endotel kaybına uğramış safen ven greftindeki düz kas hücreleri apoptozisin etkisiyle erken dönemde fibröz dokuyla yer değiştirebilir. Bu karşılıklı değişim geç dönemde ise safen ven greftin dejenerasyonunda önemli rol oynar (20). Sonuç olarak; Vasküler düz kas hücreleri ve endoteliyal hücrelerin apoptozisi insan damarlarının gelişimi sırasında belgelendirilmiştir. Akut hasar sonrası intimal lezyonlardaki vasküler düz kas hücrelerinin turnoverinden apoptozisin sorumlu olabileceği ve medyada meydana gelen hücresel azalmaya apoptotik vasküler düz kas hücre ölümünün katkıda bulunabileceği gösterilmiştir (21). Koroner arter bypass cerrahisinin başarısı, bütün vasküler girişimlerde olduğu gibi, bypass greftlerinin uzun süre de açık kalmalarına bağlıdır. Greft başarısızlığında en büyük neden endotel hasarı gibi görünmektedir. Bu hasar, venin cerrahi olarak çıkartılması sırasında yapılan cerrahi travma, uygun olmayan solüsyonlarda bekletme ve vücut dışında anastomoza kadar geçen bekleme süresinin uzamasına bağlı serbest oksijen radikalleri ve iskemiye bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. KABG operasyonları sırasında greft olarak kullanılan safen vende, uygun hazırlama ve saklama solüsyonu olarak birçok sıvı kullanılmış. Yapılan çalışmalarda serum fizyolojik ve laktatlı Ringer sürekli kontrol grubu olarak alınmıştır. Fakat kendi aralarında kapsamlı karşılaştırmalı bir çalışma yapılmamıştır. Bundan dolayıdır ki kardiyovasküler klinikler tarafından en çok tercih edilen bu iki solüsyonun endotel hasarı üzerine etkilerini göstermek, endotel hasarı en aza indirgenerek greft patensi (açıklık) oranı arttırmak, intimal hiperplazi oranını düşürmek ve hastada uzayan greft açıklık süresi ile beklenen yaşam süresini uzatmak hedeflenmiştir. Bu çalışmada; koroner arter hastalarında uygulanan, KABG operasyonlarında bypass grefti amaçlı kullanılan safen venin, implantasyona kadar geçen sürede, serum fizyolojik ve laktatlı Ringer solüsyolarında bekletilmesinin endotel hasarı üzerine etkileri değerlendirilecek ve karşılaştırılacaktır. 3 GENEL BİLGİLER KORONER ARTER BYPASS CERRAHİSİ Kalp cerrahisi günümüzde bulunduğu düzeye gelinceye kadar hızlı bir gelişme göstermiştir (1,2). Karanlık çağlarda kalple ilgili bilgiler gözlemlerle ve kalbe ilişkin yaralanmalar sonucu meydana gelen değişikliklerle sınırlı iken, günümüzde tüm dünyada sıklıkla uygulanan bir cerrahi yöntem olarak literatürde yer almaktadır (1-3). Koroner arter hastalığında miyokardın revaskülarizasyonu için KABG en etkili ve uzun süreli çözümdür (22). KABG, gelişmiş ülkelerde yapılan en sık majör operasyondur ve tüm dünyada her yıl yaklaşık 1 milyon hastaya yapılmaktadır (4). Ülkemizde ise bu rakamın yaklaşık yıllık 20.000 düzeyinde olduğu tahmin edilmektedir. İskemik kalp hastalıklarına yönelik ilk cerrahi girişimler 1930’lu yıllara dayanmaktadır. Beck 1932 yılında deneysel olarak, pektoral kas flebini miyokardın etrafına sararak bu yönde ilk çalışmaları başlatmıştır (1,23). 1935 yılında ilk defa insanlar üzerinde uygulanmaya başlayan bu yöntemi, sonrasında omental ve akciğer flepleri izlemiştir (24). 1941 yılında yine Beck koroner sinüsü daraltarak ve epikarda abrazyon uygulayarak granulasyon dokusunun gelişimi ile miyokardı kanlandırmayı amaçlamıştır. 1946’da Vineberg ilk defa sol ventrikül miyokardı içine İTA’yı yan dalları açık bir şekilde gömerek miyokardial kanlanmayı amaçlamıştır. Vineberg prosedürü olarak da adlandırılan bu yöntemde İTA %80-90’lara varan oranlarda patent kalmıştır (25,26). 1900’lü yılların başında köpeklerde deneysel amaçlı aortokoroner bypass ameliyatını ilk defa Alexis Carrel gerçekleştirmiştir. Bailey 1956 yılında ilk defa başarılı koroner endarterektomi ile koroner arterlerin kendisine yönelik direkt cerrahi girişimlerin gündeme 4 gelmesine yol açmıştır (27,28). 1960’lı yılların başında Sabiston ve Garrett ilk VSM’ı kullanarak aortokoroner bypass ameliyatlarını vaka takdimleri olarak yayınlamışlardır (2931). Sonrasında 1968 yılında Favoloro VSM kullanarak aortokoroner bypass ameliyatlarını yayınlamıştır (5). Bu dönemden sonra VSM yaygın kullanım alanı bulmuştur. Yine aynı yılda Green İTA kullanarak ilk koroner bypass serisini yayınlamıştır (32,33). 1960’ların sonları ile 1970’lerin başlarından itibaren aortokoroner venöz bypass ile birlikte İTA-koroner arter anostomozlarının yapılması giderek popülarite kazanmış ve günümüzde en çok yapılan büyük ameliyatlardan birisi haline gelmiştir. Diğer yandan standart miyokard revaskülarizasyon operasyonlarının dışında; robotik koroner cerrahisi, anjiyoplasti ve stent yöntemleri, hibrid yöntemler, transmiyokardiyal lazer revaskülarizasyon, genetik endojen revaskülarizasyon, anjiyojenik ve kök hücre transferi gibi alternatif stratejilerde gelişmektedir (34). Kalp cerrahisinin başarıyla gerçekleştirilebilmesi için genellikle sahanın kansız ve hareketsiz olması gerekir. Kalbin pompalama ve akciğerlerin solunum fonksiyonunu geçici olarak üstlenen cihaza kalp akciğer makinası denir. Kalp akciğer makinesini 1937 yılında Gibbon icat etmiştir (35). Kalp ve akciğerlerin devre dışı bırakıldığı ve dolaşımın kalp akciğer makinası ile sürdürüldüğü bu duruma ekstrakorporeal dolaşım, yapılan işleme ise “kardiyopulmoner bypass” denir. Kardiyopulmoner bypass ve ekstrakorporeal dolaşım, açık kalp cerrahisinin yanısıra bazı intrakranial ameliyatlarda, kan değişimi uygulamalarında (eritroblastosis fetalis), pulmoner embolektomide, akciğer, karaciğer, böbrek gibi organ transplantasyonlarında, venakavanın rezeksiyonu sırasında, donma nedeniyle hastanın ısıtılmasında ve kemoterapötiklerin verilmesi sırasında izole ekstremite perfüzyonunda da kullanılabilen bir yöntemdir (36). Koroner arter bypass yapılacak damarın darlığı kural olarak; kesit alanı %70 ya da anjiografide %50’den fazla olmalıdır. Aksi taktirde doğal koroner akım baskın olacağı için (competition) greft açıklığı tehlikeye girecektir (37). Çok damar koroner arter hastalığında miyokardın revaskülarizayonu için cerrahi tedavi en etkili ve uzun süreli bir çözümdür (2). Cerrahi sonuçlar kısa ve orta dönemde iyi iken uzun dönemde greft yetmezliğinden etkilenmektedir (6). Koroner arter bypass cerrahisinde hedef, hastalara en uzun süre açık kalacak greftlerin seçilmesidir. Greftin seçiminde hastanın yaşı, klinik durumu yanında kullanılacak greftin çap, uzunluk, duvar kalınlığı ve ateroskleroz gelişme insidensi gibi biyolojik özellikleri ve greft bulunabilirliği de tercihte belirleyici olmaktadır (2). Greftlerde bypass sonrası gelişen stenoz ve oklüzyon nedeniyle oluşan greft yetmezlikleri, greftin uzun 5 dönem açıklık oranlarını etkilemektedir. Aortokoroner bypass greftlerin cerrahi girişim sonrası ilk 3 ayda tıkanma hızları %7-12, birinci yılda %10-20 arasındadır ve yıllık %2-5 oranında ilerler. Beşinci yılda aortokoroner bypass greftlerin %25’i, onuncu yılda ise %35’i tıkanır (7). Bypass greftlerde cerrahi tekniklerle de yakından ilişkili olan; kötü distal geri akım, hiperlipidemi, vazokonstriksiyon ve vazospazm, greft iskemisi, uygunsuz greft hazırlama, saklama tekniği ve anastomoz tekniği gibi predispozan faktörler koroner arter bypass operasyonundan sonraki erken dönem komplikasyonlarından sorumludur (38). Günümüzde çok sayıda merkezde, cerrahın tercihine göre farklı greft seçimleriyle revaskülarizasyon prosedürleri uygulanmaktadır. Koroner arter bypass greftlerinde kullanılan arteriyel greftler; İTA (sol ve sağ İTA), RA, gastroepiploik arter, inferior epigastrik arter, ulnar arter, splenik arter, inferior mezenterik arterdir. Venöz greftler ise; VSM, vena safena parva (VSP) ve sefalik vendir (Tablo 1). En sık kullanılan greftler, VSM, İTA ve RA’dir. Safen ven; hızla çıkarılabilmesi, hazırlanmasının kolay olması, mükemmel bir akım sağlayabilmesi ve spazm olmaması gibi özelliklerinden dolayı koroner arter bypass cerrahisinde ilk günden beri kullanılmaktadır. Ancak distal ve proksimal çaplar arasında çap uyumsuzluğu, varikozite, skleroz ve özellikle obez, diyabetik ve periferik vasküler hastalığı olanlarda bacak yaralarında iyileşmeme gibi problemlerle karşılaşılabilmektedir (2,3). Ayrıca ven greftlerinin, progresif intimal hiperplazi ve ateroskleroz nedeniyle tıkanmaya başlaması çok erken dönemlerde ortaya çıkar. Endotel hasarı greft başarısızlığında en büyük neden gibi görünmektedir. Bu hasar venin cerrahi olarak çıkartılması sırasında yapılan aşırı germe, kaba cerrahi travma uygunsuz solüsyonlarla şişirme ve bekletme veya anastomoz öncesi vücut dışında uzun süre bekletmeye bağlı serbest oksijen radikalleri ve iskemiye bağlı olarak ortaya çıkar. Endotel kaybı, intima ve mediada akut, ancak geri dönüşlü geçici inflamatuvar hücre reaksiyonu ve ödem ile sonuçlanır. Fibrin veya trombüs intimal yüzeyde toplanır. Dört ile altı haftalık bir süreçte, düz kas hücrelerinin proliferasyonu, fibroblastlar ve endotelyal hücreler, intima kalınlaşmasına neden olur (38). On yıllık açıklık oranları venöz greftler için %40 olarak bildirilmişken, İTA için bu oran %90’dır (6). 6 Tablo 1. Koroner Arter Bypass Operasyonlarında Kullanılan Greftler (39) İnternal torasik arter Sağ gastroepiploik arter İnferior epigastrik arter Arteryel Greftler Otogreft olanlar Radial arter Splenik arter Interkostal arter Subskapular arter Vena safena magna Otogreft olanlar Vena safena parva Sefalik ve basilik venler Venöz Greftler Homogreft vena safena Otogreft olmayanlar magna Umbilikal ven PTFE, Dacron, Bovin İTA Artifisyel greftler İTA: İnternal torasik arter, PTFE: Politetrafloroetilen BÜYÜK VE KÜÇÜK SAFEN VEN Alt ekstremitelerde venöz dolaşım; yüzeyel, derin ve bunları birbirine bağlayan perforan venler olmak üzere 3 ayrı sistemden oluşur (40). Yüzeyel venler, VSM ve VSP olarak bilinir. Yüzeyel venler membranöz fasyanın üstünde seyrederler ve derin venler gibi kas kompartmanında yer almadıkları için destek dokusundan yoksundurlar. VSM ayak dorsalinde v.marginalis medialis’in devamı olarak dorsal venöz arkdan başlar, iç malleol önünden geçip, baldır iç yüzünde ilerleyerek popliteal boşluğun posteromedial kenarından uyluk iç yüzüne gelir. Buradan yukarı çıkarak yüzeyel inguinal bölgede fossa ovalisten femoral vene dökülür (40). VSM, v.communicans’lar aracılığı ile VSP ile v.perforans’lar yardımıyla da derin venöz sistemi ile bağlantı kurar (41) (Şekil 1). 7 Şekil 1. Vena safena magna (42) Postero-medial uyluk veni ve antero-medial uyluk veni gibi diğer dallar kasığın yakınlarında safen sistemde sonlanır. Bu venlerden her biri bulundukları bölgelerde variköz kümelere dönüşebilir (40). Vena safena parva ise ayak lateralindeki dorsal venöz arktan başlayarak baldır orta kesiminden yukarı çıkar ve VSM’ den farklı olarak derin fasyayı penetre ederek popliteal vene dökülür. Variköz venlerin oluşumunda VSP’den daha çok VSM sorumludur (40). Yüzeyel venlerde distalde kapakçık sayısı proksimale göre fazladır. Bileşke bölgelerindeki kapakçıklar daha kuvvetli olup, kapakçık içeren kısımlardaki ven duvarında belirgin sinüzoid genişlemeler vardır. VSM’de en az 6 kapakçık vardır. Bunlardan biri, olguların %85’inde safeno-femoral bileşkenin 2-3cm distalindedir. VSP’de ise kapakçıklar birbirine yakın olup sayıları 4-13 arasında değişir (40). Venöz sistemin ısı regulasyonu, taşıma, muskulo-venöz pompa yanında diğer önemli bir görevi de kan depolamadır (43). 8 Venöz sistem volümü arterden üç kez daha fazla olup total kan volümünün %64’ünü oluşturur (43). Alt ekstremite yüzeyel venler ise bu volümün % 15-20’sini oluştururlar. Böylece kolay ulaşılabilir olması ve düşük volüm kapasitesi nedeniyle çıkarılmaları sonrasında komplikasyon çok az görülebilir. Bu yüzden alt ekstremite yüzeyel safen venleri koroner arter bypass ve periferik damar cerrahisinde sıklıkla kullanılır. Vena Safena Magna, ven greftleri içerisinde en yaygın kullanılan grefttir. Uzun dönem sonuçları açısından 5 yıllık patensi oranları LAD pozisyonunda %80’lerde, diğer damarlarda %60’lar düzeyindedir (44-46). Bacak venleri uygun olmadığında, kol venleri en son çare olarak kullanılabilir (47). Venler histolojik yapılarından dolayı arterlerden farklı özelliklere sahiptirler. Bu farklılık ven duvarının sistemik basınca arter duvarı kadar dayanıklı olmaması, kandan venlere lipid geri alınımı, venlerde lipid sentezinin daha aktif olması ve lipid yıkım hızının daha yavaş olması şeklinde özetlenebilir (48-50). Bu özellikler venlerde intimal hiperplazi ve aterosklerozun daha hızlı gelişimine yol açar. Vena safena magna çıkarılırken, damarın travmatize etmeden çıkarılmasına dikkat edilmelidir. Ven duvarında oluşabilecek hasar, intimal hiperplazi gelişimine yol açarak greftin erken dönemde stenozuna neden olan en önemli faktördür (8-10). Bu yüzden damar adventisyadan tutulmalı tam kat manüplasyondan ise kaçınılmalıdır. Yan dalların kapatılması ince 4/0 ipek veya klipslerle, damar duvarını distorsiyona uğratmadan 1-2mm mesafeden yapılmalıdır. Ven grefti çıkarıldıktan sonra dengeli elektrolit solüsyonları içerisinde saklanmalıdır. Bazı cerrahlar saklama solüsyonları içerisine heparinize kan ve papaverin de koymaktadırlar. Bir diğer önemli nokta da saklama süresidir. Genellikle çalışmalar bir saate kadar olan iskemik sürenin iyi tolere edildiğini, bir saatten sonra endotel hasarının gelişmeye başladığını göstermektedir (51,52). Ven greftinin çıkarıldıktan sonra distansiyonu oluşabilecek damar spazmalarını önleyen bir faktördür. Burada dikkat edilmesi gereken nokta çok yüksek basınçla distansiyondan kaçınmaktır. Bu durum endotel hasarına yol açan diğer önemli bir faktördür (53,54). Bazı cerrahlar bu durumu önlemek amacıyla arteriyel kanüle bağlanan bir hat vasıtası ile sistemik arteriyel basınçta ven dilatasyonunu yaparlar. Son olarak ven grefti hazırlanırken dikkat edilmesi gereken diğer bir faktör cilt insizyonları ve enfeksiyonudur. Özellikle şişman hastalarda bacak enfeksiyonları sıkça ortaya çıkmakta ve bu durum hasta açısından sorun teşkil etmektedir. Bu durumun önlenebilmesi için yara çok dikkatli kapatılmalı, hematom oluşumu önlenmeli, multipl insizyonlar ile ven grefti çıkarılmalıdır. Son yıllarda gündeme gelen endoskopik ven çıkarılması yöntemi ile yara problemlerinin daha az ortaya çıktığı gözlenmiştir (55). 9 Ven greftlerinin %10-15’i ilk bir ay içerisinde tıkanmaktadır. Bir yıl içerisinde ise bu orana ilaveten %5-10 oranında tıkanma görülür. İlk bir yıl içerisindeki stenozlarda distal anastomozdaki teknik hata, greftin kısa olması ve buna bağlı anastomoz hattında oluşan gerilim, ven grefti hazırlanırken oluşan endotel hasarı ve buna bağlı gelişen erken dönem intimal hiperplazi en önemli rolü oynar (56-59). Bu dönemde kardiyopulmoner bypass’a bağlı gelişen trombosit aktivasyonu ve hiperkoagulabilite ve kan akımında oluşabilecek staz diğer önemli faktörlerdir (11). İlk bir yıldan sonra fibröz intimal hiperplazi, greft stenozlarında en önemli faktör olarak karşımıza çıkar. Araştırmalar fibröz intimal hiperplazinin ameliyat sonrası altı hafta içinde gelişmeye başladığını gösterse bile bu tablo ilk bir yılda sonra belirgin hale gelir. Bir ile beş yıl arasındaki dönem ven greftleri açısından “altın dönem” olarak adlandırılır. Bu dönemde ven greftleri yılda %2-3 oranında stenoza uğrar. Bu dönemde fibröz intimal hiperplazi genelde stabil kalır ve daha çok ateroskleroz ön plana çıkar. Beş yıldan sonra, ven greftleri yılda %5 oranında stenoza uğrar ve bu dönemde ana pataloji ateroskleroz olarak karşımıza çıkar. Bu oranlar dikkate alındığında ven greftlerinin yaklaşık %50’si on yıl içerisinde stenoza uğramaktadır. Bununla beraber VSM günümüzde hala en çok tercih edilen konduitlerden biri olarak birçok cerrah tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır. Ven grefti stenozunu önlemek amacıyla erken dönemde antitrombosit tedaviye başlanmalı ve hiperlipidemi agresif olarak tedavi edilmeli, LDL kolesterol değerlerinin 100mg/dl altına çekilmesine gayret edilmelidir. VENLERİN MORFOLOJİK VE HİSTOLOJİK YAPISI Kan, kalbe kapiller ağdan venler arcılığı ile taşınır. Venlerin kalbe doğru ilerlerken duvarları kalınlaşır, çapları dereceli olarak artar, yaklaşık 1mm'den 4cm'ye kadar varabilen çaplarda değişik genişliklerde olabilirler. Venlerin arterlere oranla daha geniş lümenleri ve daha ince duvarları vardır. Arterlerden daha fazla sayıda olmakla birlikte yine arterlere göre duvarları daha esnek ve daha az elastiktir. Bu şekilde alınan kesitlerde, venler genellikle kollabe ve lümenleri düzensiz ve yarıklıdır. Fakat venlerin duvar yapısı ile çapları her zaman uyumlu olmayabilir. Ayrıca çok fazla varyasyon gösterir, aynı venin farklı bölgeleri dahi kendi aralarında farklılıklar gösterebilir. Arterlerde görülen musküler ve elastik doku venlerde neredeyse gelişmemiştir, oysa bağ dokusu komponentleri çok daha belirgindir (60). Venler histolojik olarak aşağıdaki tunika intima, media ve adventisya tabakalarından oluşmaktadır (60,61) (Şekil 2). 10 t: tunika Şekil 2. Orta çaplı venlerin şematik diyagramı (62) Tunika İntima (Tİ) Yapısal olarak intimal tabaka, endotel, subendotelyal tabaka ve lamina elastica internadan oluşmaktadır. Bu yapısı ile de arter duvarıyla benzerlik göstermektedir. Tunika Media (TM) Yapısal olarak heliks biçiminde dizilmiş düz kas hücre tabakalarından oluşmaktadır. Bu kas hücreleri arasında elastik ve kollegen lifler bulunmaktadır. Mevcut retiküler lifler çoğunlukla tip 3 kollagenden oluşmaktadır. Tunika Adventisya (TA) Yapısal olarak uzunlamasına dizilimli kollagen ve elastik liflerden oluşmaktadır. Buradaki kollajen, çoğunlukla tip l'dir. TA genellikle içinden geçtiği organın etrafını saran bağ dokusu ile kaynaşmaktadır. Bazı büyük ven TA’larında, kan akımının yer çekiminin karşıt yönünde oluşmasını sağlayan uzunlamasına ve dairesel düzenlenmiş kas demetleri bulunmaktadır. Bu kas demetleri aynı zamanda venin gerilmesini önlemekte ve damara direnç 11 kazandırmaktadır. TA, ayrıca sinir ve kapiller ağlar içerir. Venlerde en gelişmiş tabaka ise TA’dır (63) (Şekil 3). Şekil 3. Venöz damar yapısı (42) Endotel hücre tabakası, damarların iç yüzeyini döşeyen tek sıra yassı epital hücrelerden meydana gelir. Damar iç yüzeyini döşeyen bu endotel hücreleri, bazal lamina üzerinde bulunmaktadır. Endotelin hemen altında seyrek düz kas hücreleri içerebilen gevşek bağ dokusunun oluşturduğu subendotelyal tabaka bulunur (Şekil 4). Şekil 4. Damar duvarı ve katları (62) 12 Venöz kapakçıklar, küçük ve orta boy venlerde iki endoteliyal kıvrım konkavitesinden meydana gelmişlerdir. Fibroelastik tabaka içerirler ve bu tabaka ise kapakçıkların sıkılığını sağlar. Venöz kapakçıklar, elastik bağ dokusuna sahiptirler ve dıştan iki tarafta da endotel ile kaplıdırlar. Lamina elastica interna, arterlere göre ven duvarlarında çok daha az gelişmiştir. Bu yüzden ven duvarı kapakçık bölgesinde daha incedir (64). Kapakçıkların açılımı akım yönüne doğrudur. Görevleri ise reflüyü önlemektir (Şekil 5). Şekil 5. Venöz Kapakçık Fonksiyonu (42) Vasküler duvarlar, vasa vasorum denilen kendi besleyici damarları ile donatılmıştır. İyi gelişmiş media tabakasına sahip büyük damarlarda, intima besin materyalini mikrovaskulatuarda olduğu gibi sadece luminal kandan diffüzyon yoluyla almaz, bunun yanında beslenme adventisyada ve bazı arterlerde medianın dış katmanında bulunan vasa vasorumlarla sağlanır. Duvarın geri kalan kısmı ise diffüzyonla beslenir. Venlerin vasa vasorumları daha bol olmakla birlikte intimaya arterlerin vasa vasorumlarından daha çok penetre olurlar (65). VASKÜLER ENDOTELYAL HÜCRELER Vasküler sistemde bütün damarlar bazal membran üzerine oturmuş olan devamlı bir endotelle döşelidir. Endotel, tek tabaka poligonalden, romboid veya elipsoide değişen şekillerdeki hücrelerden oluşur. Damarın longitudinal ekseni boyunca dizilen bu endotel 13 hücrelerinin eni 15μm boyu ise 25-30μm'dir. Endotel hücresi şişkin nükleusa sahiptir. Endotel hücreleri metabolik fonksiyonları çok olan hücre grubu olmasına rağmen, diğer hücre ve dokulara nazaran daha düşük bir biyokimyasal aktivitesi mevcuttur. Bu hücrelerin düşük biyokimyasal aktivitesini, az sayıda serbest ribozom, az miktarda endoplazmik retikulum ve küçük bir Golgi kompleks varlığı yansıtmaktadır. Sitoplazmada bol miktarda 9-11nm çaplı mikroflament gözlenmesi bu hücrelerin kasılabilir olduklarını düşündürmektedir. Endotel hücreleri, sitoplazmalarının üst üste binmiş konumlarıyla kiremit çatı şekli görünümündedirler. Endotel hücreleri arasında birtakım bağlantı yerleri vardır. Ara bağlantılar, interselüler iletişimin gerçekleştiği bölgelerdir. Sıkı bağlantı yerleri ise hücreler arası madde alışverişinde rol oynar. Yarı geçirgen bir membran olarak endotel, arteriyel duvar içine ve kapillerlerin ve venüllerin duvarları içinden küçük ve büyük moleküllerin geçişlerini kontrol eder. Endotel hücreleri, kan ve dokular arasındaki etkileşimde aktif bir katılımcıdır (66,67). Endotel hücreleri "iletişimi baskılanmış" hücre gruplarından biridir. Bu hücreler hasar sonrasında gelişen kayıp hücrenin yerini birbirleri vasıtasıyla kaynaşarak kapatma yeteneğinden yoksundurlar. Oluşan bu hücresel hasar, kayıp hücrelerin kenarlarındaki ve hemen yakınındaki hücrelerle telafi edilir. Bu mekanizma yakın komşuluktaki hücrelerin hem bölünmelerini, hem de mevcut boşlukları doldurmak için göç etmelerini zorunlu hale getirmektedir. Bu olay, özellikle aterogenez sürecinde rol oynamaktadır. Vazoaktif maddeleri salgılama yoluyla, vasküler düz kas hücre relaksasyonu ve plateletlerin proagregatuar ve antiagregatuar davranışları arasındaki dengeyi koruyarak antitrombotik özelliklerin sağlanmasında görev almaktadır (68). Kapiller endotel hücrelerinin bazı metabolik işlevleri de vardır. Bradikinin, serotonin ve prostaglandinlerin biyolojik inaktivasyonunu gerçekleştirirler. Ayrıca trombositlerin damar duvarına yapışmasını engelleyen bir madde olan prostasiklini sentezlemektedirler (69). Eskiden sadece mekanik bir bariyer olduğu düşünülen endotel hücrelerinin bugün vasküler tonus, permeabilite, transport, inflamasyon ve koagülasyon gibi pek çok olayın içinde aktif olarak yer aldığı bilinmektedir. Endotel hücreleri çok çeşitli mediyatörler sentezleyerek bu olaylara katılır ve inflamasyon, tromboz veya damar hasarını izleyerek hücreler arası iletişim ve etkileşimi yönetirler. Sağlıklı bir damar duvarı için sağlıklı bir endotel hücre tabakasına gereksinim olduğu açıktır. Endotel hücrelerinin mekanik veya fonksiyonel bütünlüğünün bozulması vasküler hasarın başlaması ve sürdürülmesine neden olan pek çok sayıda patofizyolojik mekanizmayı tetikler (70). 14 Endotelyal disfonksiyon, yapısal olarak sağlam olan endotel hücrelerinin çeşitli uyaranlara bazı fonksiyonlarında ayarlama yaparak ve yeni özellikler kazanarak cevap vermesidir ve sıklıkla çevresel uyarılara cevap olarak oluşan, endotel hücrelerinin fonksiyonel durumunda potansiyel olarak geriye dönüşlü değişiklikleri tanımlamada kullanılır. Endotelyal disfonksiyonda, vazodilatör ve vazokonstrüktörlerin endotelyal üretimi arasındaki denge bozulmuştur. Endotel hücreleri birçok stimulusla en çok da sitokinlerle aktive olarak endotelyal lökosit adhezyon molekülleri, büyüme faktörleri, sitokinler ve vazoaktif meditörlerin indüksiyonunu sağlarlar (67). Günümüzde endotel disfonksiyonunun kardiyovasküler risk faktörlerine yanıt olarak ortaya çıkıp, aterosklerozun gelişimine öncülük ettiği düşüncesi herkes tarafından kabul edilmektedir. Yayınlanmış bilgiler ışığında, endotel disfonksiyonu, risk faktörleri ile aterosklerotik yük arasındaki köprü olarak değerlendirilmekte ve aterosklerozun erken ve geç dönem mekanizmalarını uyararak plak oluşumunda aktif rol oynamaktadır (71). Endotel, damar yapısının korunmasında, en önemli homeostatik düzenleyicidir. Endotelin en önemli görevleri vazodilatasyonun sağlanması, düz kas hücre büyümesinin ve inflamatuvar yanıtın baskılanmasıdır. Bu görevler büyük ölçüde en önemli endotelyal vazodilatör olan nitrik oksit, prostasiklin ve bradikinin tarafından sağlanmaktadır. Endotel hasarı, vazodilatasyon ve vazokonstriksiyon arasındaki dengeyi bozar ve aterosklerotik süreci başlatarak hızlandırır. Endotel disfonksiyonu bu yönüyle, ateroskleroz belirteci olarak da kabul edilebilir. Nitekim aterosklerotik risk faktörleri endotel disfonksiyon etiyopatogenezinde de rol oynar (72). Endotelyal fonksiyon, özellikle arterlerde ateroskleroz gelişimini etkileyebilir (73). Majör kardiyovasküler risk faktörleri endotelyum bağımlı vazoaktif homeostazisi etkilemektedir. Diyabet, hipertansiyon, hiperkolesterolemi gibi risk faktörlerin varlığında, vazodilatör ve vazokonstrüktör faktörlerin endotelyal üretimi arasındaki denge bozulmuştur. Bu durumda, düz kas hücre migrasyon ve proliferasyonunun kontrolü kaybolmakta ve bu durum, intimal hiperplazi ve ateroskleroz gelişmesine öncülük etmektedir. Ayrıca hipertansiyon, diyabet ve hiperkolesterolemide zedelenmiş relaksasyon ve antitrombotik kapasite vazokonstrüksiyon ve trombüs oluşumunu kolaylaştırır. Bu durum greft olarak kullanılan damarların vazospazmına, erken ve geç greft disfonksiyonu ve yetmezliğine neden olabilir (68). Koroner arter bypass uygulamalarında; greftin travmatik çıkartılmasından, uygun saklama solüsyonlarının kullanılmaması ve implantasyona kadar geçen sürenin uzaması 15 sonucu oluşan endotel hasarı, erken ve geç postoperatif dönemde greftin açıklık oranında önemli rol oynamaktadır. Endotel fonksiyonlarındaki bozulma greft açıklığının erken dönemde riske girmesi yanında greftte aterosklerozun gelişmesinde de ilk adımdır. Erken greft başarısızlığı: Operasyondan sonraki ilk 30 gün içerisinde görülür. Hızlı greft trombozu genellikle anastomoz hattında tıkayıcı sütur, intimal flep veya greftin kendi üstüne katlanması gibi nedenlerle ortaya çıkar. Tüm greft başarısızlıklarının %5’inden az bir sıklıkta görülür (7). Orta dönem greft başarısızlığı: Özellikle anastomoz bölgesinde ve greft duvarında ilk iki yıl içinde görülen fibröz hiperplazi nedeniyle ortaya çıkar ve %15-20 oranında greft başarısızlıklarından sorumludur. Fibröz hiperplazi gelişimi (yumuşak kas hücrelerinin intimaya göçü, gelişmesi ve ekstrasellüler matriks üretimi) daha çok endotel disfonksiyonu ve/veya endotel hasarlanması ile başlamaktadır. İntimal hiperplazi greft tıkanmasına neden olmakla beraber genellikle kendi kendini sınırlayan bir süreçtir ve çoğunlukla greft konulduktan iki yıl sonrasında gelişimi yavaşlamaya başlar (7). Fibröz hiperplazi oluşumunu kolaylaştıran faktörler arasında; cerrahi travma, greft arter uyumsuzluğu, arteriyelize venin damar yüzeyinin trombozu, iyi olamayan anastomoz endotelizasyonu sayılabilir. Geç dönem greft başarısızlığı: Beş yıldan daha yaşlı ven greftlerinde, hızlanmış ateroskleroz gelişmesi greft başarısızlığında etkendir. Bu tip ateroskleroz normal damarlarda doğal gelişimli aterosklerozdan daha şiddetli, hızlı ve belirgindir. Hızlanmış aterosklerozda T hücreleri ve makrofajların birincil rol oynadığı düşünülmektedir (7). TROMBOZİS Erken ve orta dönem greft trombozunun temel nedeni venin hazırlanması evresinde yapılan travmadır. Greft hazırlanırken optimal şartlar sağlansa da endotelyal ayrışmalar oluşmaktadır (74). Özellikle pedikülsüz bir biçimde çıkartıldığında safen ven, dolaşımdaki potent vazokonstriktör olan endotelin-1 (E-1)’e daha duyarlıdır. Kardiyopulmoner bypass başladığında E-1 düzeyi belirgin olarak artış gösterir. Bu da venokonstriktör cevaba neden olarak spazmla akımın azalması ve stazın artmasına yol açabilir (62). Greft hazırlanırken oluşan spazmı gidermek amacıyla yüksek basınçla veni şişirmek endotel kaybı ve media hasarı yapabilir. Endotel kaybı luminal yüzde fibrin birikimine neden olur, erken greft açıklığını azaltan faktörlerden olan plateletler ve nötrofiller ortamda artar, doku plazminojen aktivatör üretimi azalır (12) . Endotel kaybı eksojen koagülasyon kaskatını aktive eder. Doku faktörü kardiyopulmoner bypass’a geçtikten 2 saat içinde inflamatuvar 16 sitokinlerce aktive endotel üzerinde yayılır. Trombomodulin normal endotelden salınan ve trombinle bağlanarak antitrombik etki gösteren önemli bir ajandır ve Protein C gibi dolaşan antikoagulanları aktive eder. Ven hazırlanırken trombomodulin aktivitesi %30’un üzerinde azalır (75). Erken greft oklüzyonunda protrombotik faktörler etkili olduğu gibi venöz kapakların duruyor olması, anastomoz darlıkları, ateromlu bölgeye anastomozun yapılması gibi greft akımını azaltan teknik faktörler de önemlidir (62). İNTİMAL HİPERPLAZİ İntimal hiperplazi, ekstrasellüler matriksin ve düz kas hücrelerinin intimal kompartmanda birikmesi olarak tanımlanabilir ve implante ven greftlerinde ilk bir aydan iki yıla kadar olan dönemde gelişen majör greft hastalığıdır. Greft olarak kullanılmadan önce birçok ven orta derecede intimal ve medial fibrozis gösterebilir. Ancak arteriyel sisteme implante olan hemen tüm venlerde intimal kalınlaşma ilk 4-6 hafta içinde gelişerek lümende %25 kadar daralma yapabilir (13). Bu süreç tek başına nadiren önemli stenoza neden olur. Akut olarak arteriyel basınçla karşılaşma sonucunda safen vende duvar stresinde artma ve endotel kaybı olur. Büyüme üzerine uyarıcı ve inhibitör pek çok faktör içeren endotel hücrelerinin tahribatı, intimal büyüme üzerindeki kontrolün kalkmasına ve intimal hiperplazi gelişmesine neden olur. Başlangıçta aktive endotel hücreleri, plateletler ve makrofajlardan salınan çok sayıda büyüme faktörleri ve sitokinlere bağlı olarak medial düz kas hücrelerinde proliferasyon gelişir. Sonra düz kas hücreleri intimaya göç eder ve daha sonra ise ekstrasellüler matriks sentezi ve depolanması gerçekleşir (76). Arterlere göre venlerde daha önemli olan vazo vazorumlardan kan sunumunun kaybı iskemik ve fibrotik sürecin devamına neden olur. ATEROSKLEROZİS Bypass cerrahisinden sonraki ilk yıldan itibaren iskemik belirtilerin tekrar ortaya çıkması ve safen vende oluşan zayıflamanın temel nedeni aterosklerozisdir. Nativ koroner arter hastalığı yıllık %5 oranında ilerleme gösterir ve nativ damar hastalığının ilerlemesi de iskemik belirtilerin tekrar ortaya çıkmasında önemlidir. Ancak bypass cerrahisinden sonra gelişen miyokard iskemilerinde %70-85 olguda suçlu lezyon, trombüsle yüklenmiş ven greft aterosklerozisidir (13). 17 Otopsi çalışmalarında, safen ven greftlerinde bypasstan sonraki ilk 1 yıl içinde ateromatöz plağa ait deliller bulunmuştur. Fakat semptomatik olgularda hemodinamik olarak önemli stenoz, greft konulduktan sonraki üçüncü yıldan önce nadir görülmektedir. Klinik olarak önemli greft stenozu belirgin olarak 5-7. yıllarda artış gösterir. Temel olarak arteriyel sistemdeki patogeneze benzemekle birlikte, venlerde histolojik ve topografik bazı farklılıklar vardır. Ven greft ateromu histolojik olarak yüksek oranda köpük hücresi, inflamatuvar hücreler ve multinükleer dev hücreler içerir. Morfolojik olarak ven greft aterosklerozisi yaygın, konsentrik ve gevrektir, fibröz kapsülleri çok zayıf veya yoktur ve yetersiz kalsifiye yapılardır. Nativ damar aterosklerozu ise proksimal, fokal, eksantrik, dayanıklı, sağlam, iyi gelişmiş fibröz kapsülü olan ve sıklıkla kalsifik ateromlardır (13). Greftlerdeki ateroskleroz gelişimi ve sonuçları, Şekil 6’da verilmiştir (77). LDL: Düşük yoğunluklu lipoprotein Şekil 6. Greftlerdeki ateroskleroz gelişimi ve sonuçları (77) NİTRİK OKSİT 1980 yılında ilk olarak Furchgott ve Zawadzki endotel kaynaklı gevşetici faktörün (EDRF: Endothelium Derived Relaxing Factor) vasküler tonus üzerine olan etkilerini tespit etmiştir (78). Bu çalışmada intakt ve perfüzyonu düzgün olan tavşan aort kesitlerinde noradrenalin ile oluşturulan vasokonstrüksiyonun asetilkolin ile vazorelaksasyona dönüştüğü, fakat endotel tabakası çıkarılan aort kesitlerinde vasküler düz kasın vasodilatasyon yeteneğinin kaybolduğu gözlenmiştir. Bu nedenle EDRF olarak tanımladıkları nonprostanoid 18 vasodilatör bir maddenin varlığına işaret etmişlerdir. Daha sonra yapılan çalışmalarda bu yeni faktörün normal endotel tarafından salındığı ve çeşitli ilaç ve ilaç dışı maddeler ile salınımının arttırıldığı gözlenmiştir (78). 1987’de Furchgott ve Vanhoutte (79) ile Ignarro (80) bağımsız olarak yaptıkları çalışmalarda NO ile EDRF’nin benzer biyolojik özellikler gösterdiklerini buldular. Palmer ve ark. (81,82) eş zamanlı biyoanaliz ve kimyasal analiz yoluyla NO ile EDRF’nin aynı biyolojik aktiviteleri olduğunu ve L arginin prekürsörleri olduğunu gösterdiler (83). EDRF ve NO’in her ikisi de nitrovazodilatör etkilerini cGMP stimülasyonuyla oluşturmaktadır. cGMP, protein kinazı aktive eder ve myozinin hafif zincirindeki defosforilasyonuna sebep olur ve böylece kas relaksasyonu gerçekleşir (14,84) (Şekil.7). Ca+2: Kalsiyum, NOS: Nitrik oksit sentaz, GTP: Guanizin trifosfat, sGC: Guanin core NO: Nitrik oksit, L-arg: L arginin Şekil 7. Nitrik oksit sentazın aktive edilerek nitrik oksit sentezlenmesi ve nitrik oksitin etkisi (84) Nitrik oksit, L-arjininin guanidin N terminalinden nitrik oksit sentaz (NOS) tarafından sentezlenir (14,83) (Şekil 8). NOS’un tip I (nöronal: nNOS), tip II (inducible: iNOS) ve tip III (endoteliyal: eNOS) olmak üzere 3 formu vardır. eNOS endotele özgüdür. eNOS ve nNOS vücutta kardiyovasküler fizyolojide rol oynayan birçok hücrede bulunur. Bu izoformlar kalsiyum (Ca+2)/kalmodilin bağımlıdır. NO yapımı endotele bağımlı relaksasyonun temelini oluşturur. Bu etki koroner, sistemik, mezenterik, pulmoner ve serebral arter ve venlerde meydana gelir (83). 19 Şekil 8. L-Argininden nitrik oksit biyosentezi (14) Endotelyal NO sentezi, plateletlerin agregasyonuna ve lökositlerin adezyonuna etki eder. NO inhibisyonunu sağlayan NG-Monometil-L-Arginin (L-NMMA)’in invitro vasküler yatağa ilave edilmesi ile plateletlerin ve lökositlerin adezyonu artmaktadır (14). Eğer endotel, kan akımı ve kan basıncını sürdürmede otokrin rol oynuyorsa; endotel hasarı, kardiyovasküler hastalığa neden olacaktır (85). Fonksiyonları bozulmuş bir endotelin başlıca belirtilerinden biri, biyolojik açıdan yararlanılabilir NO düzeylerinin düşük oluşudur. Bu, NO sentezindeki bir düşme ya da lokal olarak reaktif oksijen türevlerinin (ROT) yapımının artışına bağlı NO inaktivasyonundaki bir artışın sonucu olarak ortaya çıkabilir (86). Endotel disfonksiyonu (ED), genetik veya kazanılmış bir bozukluk olarak tarif edilebilir. ED genellikle sonradan kazanılır. Sigara ve diyetle gelişen hiperlipidemi, travma veya uzayan iskemi sonucunda bozulmuş endotel fonksiyonu, endotel bağımlı vazodilatasyonun baskılanması ve vasküler adezyonun artması ile ilişkilidir. NO ve prostasiklin gibi endotelyal faktörlerin üretimi, salınımı ve etkilerindeki bozukluk; mental ve fiziki streslerde vazodilatör tonusun azalmasına ve paradoksik vasküler cevap oluşumuna neden olur (14). Venöz greft yetersizliğin önlenmesinde NO önemli bir rol oynar. NO’nun vazodilatasyon, antiplatelet aktivite, neointimal hiperplazi ve aterosklerozisde önemli rolü vardır. NO siklik guanosin 5-monofosfat (cGMP) oluşumunu artırır. Guanosin 5-monofosfat artışı vazodilatasyona ve trombosit agregasyonunun inhibisyonuna sebep olur. Bu etkilerine 20 ilave olarak nötrofillerin endotel yüzeyine adezyonunu azaltır. Aynı zamanda serbest oksijen radikallerini ortadan kaldırarak hücre koruyucu etki yaptığı da gösterilmiştir. Nitrik oksit düz kas hücre proliferasyonunu inhibe ederek neointimal hiperplaziyi de sınırlar (87). Kown ve ark. (88) L-arginin ile venöz greftlerde NO seviyesinin artışını ve neointimal hiperplazinin azaldığını göstermişlerdir. Sonuç olarak cerrahi manüplasyonla travmatik endotelyal hücre kaybı sonucu NO’nun biyolojik etkileri kaybolur ve endotelyal hücre hasarı aterosklerozu başlatan olaylardan biridir. CD34 ( ENDOTEL PROGENİTÖR HÜCRELER ) Endotelyal progenitör hücreler (EPH) kemik iliğinden köken alırlar. Vasküler endoteli destekler ve ateroskleroz gelişimine karşı koruyucudur. Ateroskleroz endotel fonksiyon bozukluğu ve vasküler endotelin kronik hasarlanması ile karakterizedir. Yapılan birçok çalışmada endotel disfonksiyonunun varlığı ve yaygınlığının kardiyovasküler hastalık riski ve koroner arter hastalığı olan hastalar için güçlü bir prediktör olduğu gösterilmiştir. Endotel hücre apoptozisi, nitrik oksit biyoyararlanırlılığının azalması gibi çok çeşitli moleküllerin olayda anahtar rol oynadığı düşünülmektedir. Sürekli endotel hasarına yanıt olarak endotelyal rejenerasyon için çeşitli tamir mekanizmaları devreye girer. Matür endotel hücrelerinin rejeneratif kapasitesi sınırlıdır. Dolaşan EPH’e özellikle de bunların postnatal neovaskülarizasyondaki rollerine ve endotele integre olma fonksiyonuna ilgi giderek artmaktadır. Yakın zamanda in vivo ve in vitro çalışmalarda endotelyal progenitör hücrelerin aterosklerotik plağın ilerlemesinin inhibisyonunda önemli olan hasar sonrası vasküler rejenerasyonda rolü olabileceği gösterilmiştir (89). Farelerde bu hücrelerin sistemik verilmesi ile endotel disfonksiyonu ve neointimal formasyonun azaldığı ve aterosklerotik plak progresyonun bozulduğu görülmüştür (90). Azalmış dolaşan EPH sayısı endotelyal disfonksiyon, kesinleşmiş kardiyovasküler hastalığı olmayan hastalarda yüksek Framingham risk faktör skoru ve 10-12 aylık takipte artmış aterosklerotik olay riski ile ilişkilidir (91). Hücre kültürleri ve hayvan çalışmaları; EPH’nin, endotel disfonksiyonu ve ateroskleroz gelişiminde koruyucu rol oynadığını düşündürmektedir. Bu hücrelerin insan üzerindeki patofizyolojik rolü çok açık değildir (15). Prematür EPH’in, iskemik olaylardan sonraki anjiyogenezin yanında doku yenilenmesinde de etkili olduğu gösterilmiştir. EPH’in aynı zamanda erişkinlerde damar tamiri ile de ilişkisi olabilir. Son dönemde yapılan 21 çalışmalarda dolaşan EPH’nin; statin, östrojen veya egzersiz ile sayısının arttırılmasının vasküler hasar sonrası reendotelizasyonu iyileştirebileceği öne sürülmüştür (16,17). Risk faktörlerine kronik olarak maruz kalma endotel hücrelerinde hasara neden olur ve onların yenilenmelerini gerektirir. Risk faktörleri muhtemelen EPH’nin mobilizasyonunu, hasarlı vasküler alana integrasyonunu ve anjiyogenik kapasitesini de etkilemektedir. EPH disfonksiyonu yaşlanma ve apoptozla ilişkili olabileceği gibi kemik iliğindeki havuzun tükenmesi ile de ilişkili olabilir. In vivo ortamda anjiyogenik sitokinlerin düzeyinin azalması da EPH mobilizasyonunun azalması ile lişkili bulunmuştur. Vasküler endotelial büyüme faktörü (VEBF) ve NO üretiminde yaşla birlikte azalma olduğu bildirilmiştir (92,93). Bu faktörler endotel hücrelerinin mobilizasyon, migrasyon, proliferasyon ve yaşam sürelerinin azalmasında sinerjistik etki göstermektedir. APOPTOZİS 1972 yılında Kerr ve ark. (94) tarafından iskemiye maruz kalan dokunun etrafında nekrozdan daha farklı hücre ölümü gösterilmiş ve buna Latince sonbaharda ağaç veya çiçeklerden kuruyan yaprakların düşmesi anlamında ‘apoptozis’ sözcüğü ile adlandırılmıştır. Apoptozis ve embriyogenesis, immün repertuvarın gelişimi ve iltihabi olayların rezolusyonu gibi birbirinden farklı birçok süreçte istenmeyen hücrelerin eliminasyonu için gerekli bir olaydır (95). Hücre ölümü nekroz ve apoptoz olmak üzere başlıca iki şekilde meydana gelir. Nekroz ve apoptoz arasında morfolojik ve biyolojik olarak belirgin değişiklikler vardır. Nekroz kimyasal ve fiziksel zarara takiben ortaya çıkan patolojik bir ölüm şeklidir. Başta mitokondriyum olmak üzere sitoplazmik organeller hasarlanır, hücre membranı selektif permeabilitesini kaybeder ve şişerek rüptüre olur. Hücre içeriği çevre dokuya yayılarak, inflamatuvar bir cevaba neden olur (96). Apoptoziste, nekrozun aksine en çarpıcı değişiklik hücre çekirdeğinde meydana gelir. Apoptozis çok çeşitli iç ve dış uyarılar ile tetiklenebilmektedir. Örnek olarak; reaktif oksijen radikalleri, toksinler, iyonize radyasyon, çeşitli kimyasallar, kemoterapik ajanlar, ısı şoku, yaşlanma veya iskemi sonucu gelişen subletal hasarlar ve DNA hasarlanmaları hücredeki apoptotik süreci aktive edebilir. Apoptozisi indükleyen en önemli yollardan biri ölüm reseptörlerinin uyarılmasıdır. Hücreler büyüme faktörleri azlığında, hormon ve sitokinlerin sinyalleri olmadığında apoptozise giderler. Sonuç olarak çekirdekte, hücre 22 membranında, mitokondriyumda veya hücre içi herhangi bir bölgeden gelebilecek bir uyarı apoptozisi başlatabilir (97) Vasküler düz kas hücrelerinin tekrar yapılanması; primer aterosklerozda, anjiyoplasti sonrasında, restenozda, vasküler travmada ve mekanik distansiyonda meydana gelebilir. Her ne kadar bu durumların tümünde şüphesiz apoptozis meydana gelse de sonuç olarak yeniden yapılanmada, vasküler düz kas hücre apoptozisin rolü önemlidir (98). Safen ven greftindeki düz kas hücreleri apoptozisin etkisiyle erken dönemde fibröz dokuyla yer değiştirebilir. Bu karşılıklı değişim geç dönemde ise safen ven greftin dejenerasyonunda önemli rol oynar (20). Ven greftin erken dönem hasarlanmasındaki apoptotik süreçte, medial düz kas hücrelerinde önemli hasar oluşur. Bu hasarın temelinde ven greftin mediasında bulunan düz kas hücreleri, fibroblastlar ve inflamatuar hücreler önemli rol oynar (99). Mekanik distansiyon, inflamasyon ve medial iskeminin fibrozise neden olduğu ve bu medial düz kas hücre yapılanmasının programlanmış hücre ölümü (apoptozis) ile birlikte olduğu tespit edilmiştir (100). Karabulut ve ark. (101) insan safen ven greftinin koroner bypass için hazırlanması sırasında, farklı basınçlar kullanmış, 100mmHg üzerindeki basınç uygulamalarında önemli derecede endotel hasarı oluştuğunu, 100mmHg altındaki uygulamalarda daha az endotel hasarı oluştuğunu tespit etmişlerdir. Ancak yapılan çalışmalarda ven greftlerinde mekanik distansiyon olmadan da şiddetli düz kas hücre kaybı olabileceği gösterilmiştir (99). Sonuç olarak; vasküler düz kas hücreleri ve endoteliyal hücrelerin apoptozisi insan damarlarının gelişimi sırasında belgelendirilmiştir. Akut hasar sonrası intimal lezyonlardaki vasküler düz kas hücrelerinin döngüsünden apoptozisin sorumlu olabileceği ve medyada meydana gelen hücresel azalmaya apoptotik vasküler düz kas hücre ölümünün katkıda bulunabileceği gösterilmiştir (21). REAKTİF OKSİJEN TÜRLERİ (SERBEST OKSİJEN RADİKALLERİ ) Yeryüzündeki bütün canlı türleri, organik moleküllerin içindeki oksijene ihtiyaç duyarlar. Fakat anaerobik canlılarda oksijen toksik etkilidir. Bunun nedeni reaktif oksijen türlerine (ROT) karşı anaeroblarda savunma sisteminin bulunmamasıdır. Oksijen anaerobik türlerde olduğu gibi, yaşamları oksijene bağımlı olan canlılarda da oksidatif hasara neden olabilmektedir (18). 23 Kısaca oksidan-antioksidan dengenin, oksidan lehine bozulması durumunda, oksidatif hasardan söz edilebilir. Oksidatif hasar, superoksitten kaynaklanan serbest radikaller ile nitrik oksidin reaktif türlerinin neden olduğu hasarların bir toplamıdır (18). Serbest oksijen radikallerinin (süperoksid anyonu O2-, hidrojen peroksid H2O2, hidroksil radikalleri OH-) doku hasarında ve çeşitli kalp hastalıklarında rolleri olduğu ileri sürülmüştür. Serbest oksijen radikallerinin, membran fosfolipidlerinin peroksidasyonuna sebep olarak sitotoksik etki gösterdiği düşünülmektedir. Bu etki membran sıvısında geçirgenliğin artışına ve membran devamlılığında kayba neden olur ve lipid peroksidasyonu ürünü olan malondialdehit (MDA) ile sonuçlanır (19) (Şekil 9). Kan ve aort dokusundaki MDA’nın artışı ile doku hasarında serbest oksijen radikallerinin rolü olduğunu düşündürmektedir. Ca+2: Kalsiyum, DER: Düz endoplazmik retikulum, DNA: Deoksiribonükleikasit, PER: Protein endplazmik retikulum Şekil 9. Lipid peroksidasyonu (102) Endotel hücreleri shear stres ve bradikinin gibi endoteliyal agonistlere yanıt olarak oksijenden türeyen serbest radikaller ve hidrojen peroksid salgılar. Süperoksid anyonları NO aktivitesi ve endotel fonksiyonu için major belirleyicidir. Süperoksid anyonları NO’yu inaktive eder. Bu durum arterlerde vasokonstrüksiyon ile sonuçlanır. ROT ayrıca damar düz kaslarında sitozolik Ca+2 mobilizasyonunu da uyarır. Kontraktil elemanların Ca+2’a 24 duyarlılığını arttırır. Endotel kaynaklı süperoksid anyonu NO’nun kimyasal olarak antagonistidir (103). Vasküler dokularda oksijenden türeyen serbest radikallerin yapımı ve birikmesi mitokondriyal oksidatif metabolizma sonucu oluşur. Başka enzimler de NADH, NADPH oksidasyonu sonucu süperoksid anyonunu arttırabilir. Sitokrom P450 redüktaz ve siklooksijenaz okside lipid peroksidleri ve süperoksid anyonlarını oluşturur. Süperoksid radikallerinin oluşması; membran lipid ve proteinlerinin yapısını bozarak hücre fonksiyonunu engellemekte, çekirdek membranını hasarlayarak DNA’yı kırılma ve mutasyonlara açık hale getirmektedir. Bu şekilde hücre fonksiyon bozukluğu ve/veya ölümüne neden olmaktadır. Süperoksid, süperoksid dismutaz (SOD) tarafından peroksidlere çevrilir. Dismutasyon reaksiyonunun ürünü hidrojen peroksidtir. Hidrojen peroksid ise Katalaz ve glutatyon peroksidaz tarafından parçalanır (19). HEPARİN Heparin Howell tarafından 1922 yılında bulunmuştur. Suda eriyebilen mukopolisakkarit yapısındaki bu maddeye, karaciğerde bol miktarda bulunmasından dolayı bu isim verilmiştir. Heparin, molekül ağırlığı 3000-30.000 (15.000) dalton arasında değişen bir glukozaminoglikandır. Sülfat ve karboksilik asit gruplarından dolayı kuvvetli olarak asidiktir (62). Heparin, antitrombin III aracılığı ile koagülasyon üzerindeki etkisini ortaya koyar. Heparinin düşük dozları antitrombin III'ün, faktör X’a ve trombin üzerine olan etkilerini artırır. Aralıklı ve devamlı heparin tedavisi alanlarda, antitrombin III aktivitesi normal değerinin üçte birine kadar azalabilir. Heparin, paradoksal olarak trombotik eğilimi arttırabilir. Östrojen içeren oral kontraseptifler, antitrombin III düzeyini düşürüp, oral antikoagülan aktivitesini arttırırlar. Heparin, lipemik plazmayı lipoprotein lipazı aktive ederek berraklaştırır (62). Heparinin yarı ömrü 100, 400, 800U/kg verildiğinde sırasıyla 1, 2 ve 3 saattir. Heparin, heparinaz tarafından karaciğerde metabolize edilir. İnaktif metabolitler idrarla atılır. Karaciğer ve böbrek yetmezliği olan hastalarda yarılanma ömrü daha da uzamaktadır. Heparin tedavisi aktif kanaması olanlarda, hipersensitivite durumunda, hemofili hastalarında, trombositopeni, purpura, intrakranial hemoraji, aktif tüberküloz, bakteriyel endokardit, gastrointestinal ülseratif lezyonlarda, osteopeni, ağır hipertansiyon ve düşük tehdidinde kontrendikedir (104). 25 GEREÇ VE YÖNTEMLER Bu çalışma için Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi (TÜTF) Etik Kurulundan 20.04.2011 tarih ve 09/14 karar no ile onay alındı (Ek 1). TÜTF Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dalı'nda, Mayıs - Haziran 2011 tarihleri arasında aortokoroner bypass ameliyatı uygulanan, 2 bayan, 8 erkek toplam 10 hasta çalışmaya rızaları alınarak dahil edildi (Ek 2). Çalışmaya katılan hastaların ortalama yaşı 58,5 (32–77 yaş arası) idi (Tablo 2). Çalışmada bu hastalardan greft olarak kullanılması planlanan safen venlerden alınan yaklaşık 10cm’lik artık veya yan dal ven örnekleri kullanıldı. Tablo 2. Hastaların peroperatif verileri No Cins Yaş Greft Sayısı Safen Ven 1 E 60 5 4 2 E 65 3 2 3 E 49 4 3 4 K 62 3 2 5 E 59 3 2 6 E 61 4 3 7 E 32 3 2 8 E 60 3 2 9 K 60 3 2 10 E 77 2 1 26 ARAŞTIRMAYA DAHİL ETME VE ARAŞTIRMAYA ALMAMA KRİTERLERİ • 18 yaş üstü olması • Koroner Arter Hastalığına sahip olması • Kardiyovasküler Cerrahi Konsey tarafından operasyon endikasyonu konması ve opere edilmesi • Operasyon önerilip operasyonu kabul etmesi • Operasyon için kontrendikasyon durum bulunmaması Koroner bypass cerrahisinin klasik safen ven hazırlama tekniği ile aynı cerrahlar tarafından safen ven explore edildi. Safen ven greftin kullanılmayan distal bölgesinden atravmatik müdahaleyle 10cm kadar parçası alındı. Çıkarıldıktan sonra greft endotelini korumak için serum fizyolojik ile şişirilme işlemi yapılmadan safen parçası lümende darlık oluşturmayacak şekilde bütün yan dalları tek tek 4/0 ipekle bağlanarak hazırlandı. Hazırlanan safen ven parçasından kontrol grubu örneği greft ucundan atravmatik olarak 1cm uzunlukta alındı. Histopatolojik ve biyokimyasal olarak incelenmek üzere 0,5cm’lik iki eşit parçaya bölünerek uygun bir parçasının histopatolojik inceleme için fiksasyonu yapıldı, diğer parça 85 ’ye biyokimyasal inceleme için konuldu ve ikisi de kontrol grubu (fiksasyon) olarak sınıflandırıldı. Kalan safen ven grefti sekiz eşit parçaya bölünerek dört tanesi Heparinli serum fizyolojik (SF) (100mL SF solüsyonu içine 1000U heparin) solüsyonu içerisine ve geri kalan dördü ise Heparinli laktatlı ringer (LR) (100mL LR solüsyonu içine 1000U heparin) solüsyonu içerisine konuldu. 15 dakika (dk) bekletildikten sonra SF’ten histopatolojik ve biyokimyasal olarak incelenmek üzere sırası ile iki parçadan biri 15 SF grubu olarak histopatolojik inceleme için fiksasyonu yapıldı, diğer parça -85 ’ye biyokimyasal inceleme için konuldu. Aynı işlem 15 LR grubu içinde tekrarlandı. Heparinli SF ve LR solüsyonlarında kalan diğer safen ven parçaları 45dk bekletildikten sonra SF’ten histopatolojik ve biyokimyasal olarak incelenmek üzere sırası ile iki parçadan biri 45 SF grubu olarak histopatolojik inceleme için fiksasyonu yapıldı, diğer parça -85 ’ye biyokimyasal inceleme için konuldu. Aynı işlem 45 LR grubu içinde tekrarlandı. Toplamda biri kontrol grubu diğer dördü deney grubu olmak üzere beş grup oluşturuldu. Fiksasyonu yapılan örnekler TÜTF Histoloji Anabilim Dalı'nda, ışık mikroskopik inceleme (IM), immünohistokimyasal inceleme 27 ve Tunel boyama çalışılması yapılması için hazırlandı. Derin dondurucu da -85 ’ye konulan örnekler ise İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi (İÜCTF) Biyokimya Anabilim Dalı’nda dokuda biyokimyasal parametreleri çalışılmak üzere hazırlandı. HİSTOPATOLOJİK İNCELEME Işık Mikroskobik İnceleme Işık mikroskobik incelemeler için alınan safen ven örnekleri, TÜTF Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Işık Mikroskopi Laboratuvarı’nda işlemlendirildi. Bu amaçla safen ven dokuları Bouin fiksatöründe 4 gün fikse edildikten sonra yıkama işlemine geçildi. Dokular 2 gün %70’lik alkolde yıkanarak, dehidratasyon işlemine geçildi. Dokular artan alkol serilerinde (%70, 90, 96, 100) 1’er saat tutuldu. Dehidratasyon aşamasından sonra saydamlaştırma basamağı için dokular 3 seri 15’er dk toluol ile muamele edildi. Gömme işleminden önce dokular yumuşak parafinde 1 gece tutuldu. Bir sonraki gün safen ven örnekleri yumuşak parafinden alınarak 1 saat sıvı sert parafinde tutularak, bloklandı. Bu bloklardan Leica RM-2245 silindirli mikrotom kullanılarak 6μm (mikrometre) kalınlığındaki kesitler alındı. Safen ven dokusunun genel özelliklerini ortaya koyabilmek amacıyla alınan kesitler hematoksilen eozin (HE) ile boyandı. İMMÜNOHİSTOKİMYASAL İNCELEME İmmünohistokimyasal inceleme için safen ven örneklerinden 6μm kalınlığında kesitler alındı ve deparafinizasyon işlemini takiben kesitler suya indirildi. Suya indirilen kesitler antijen retrival içinde mikrodalga fırında 20dk kaynatıldı. Oda ısısında 20dk soğumaya bırakıldıktan sonra kesitler PBS ile yıkandı. Bu aşamadan sonra hidrojen peroksidaz aktivitesinin giderilmesi için metanolde (Riedel-de Häen 24229) hazırlanan %3’lük hidrojen peroksit (H2O2) ile 20dk muamele edildi. Distile su içinde çalkalanarak kesitler Fosfat Buffer Solusyonu (PBS; pH 7.6) ile yıkandı. Özgül olmayan antikor bağlanmalarını bloklamak üzere kesitlere %1 preimmün rabbit serum (Ultra V Block, LabVision, TA-015-UB) uygulandı. Daha sonra kesitler nemli chamber içinde 1/100 oranında sulandırılmış primer antikor ile 1 saat süre ile inkübe edildi. Kullanılan antikorlar, rabbit polyclonal eNOS antibody (ab66127, Abcam, USA), ve rabbit polyclonal CD 34 antibody (CD34-250591, Abbiotec, USA) idi. Kesitler 3 kez PBS ile yıkama sonrasında 20dk sekonder antikor solüsyonunda (Biotinylated Goat Anti-Mouse, LabVision, TM-015-BN) tutuldu. PBS’de 3 kez yıkanan kesitlere 20dk 28 streptavidin peroksidaz solüsyonu (Streptavidin Peroxidase, LabVision, TS-015-HR) uygulandı. Kesitlere 3 kez PBS ile yıkama sonrasında 10dk 3-amino 9 etil karbazol (AEC) kromojen solüsyonu (LabVision, TA-002-HAC) uygulaması yapıldı. Kesitler distile su ile yıkandıktan sonra 5dk Mayer hematoksilen uygulanarak zıt boyama yapıldı. Akarsuda 5dk yıkanan kesitler kapatma solüsyonu (Mounting Medium, LabVision, TA-060-UG) konarak lamel ile kapatıldı ve ışık mikroskobunda değerlendirmeye alındı. Tüm gruplarda eNOS ve CD-34 immunreaktivitelerinin yoğunluğu semikantitatif olarak saptandı (Tablo 2). Semikantitatif değerlendirme, aşağıdaki biçimde yapıldı; yok (-), zayıf (±), hafif (+), orta (++), güçlü (+++), çok güçlü (++++). TUNEL BOYAMA Parafin bloklardan lam üzerine alınan 6μm’lik kesitler 1 gece 37°C’lik etüvde tutulduktan sonra toluolde 3x5dk bekletilerek parafinden iyice arındırılarak azalan alkol serilerinden (%100, %95, %70) 3’er dk geçirilip distile suya indirildi. Distile suda 5dk tutulan kesitlere daha sonra antijen iyileştirme amacıyla 15dk oda ısısında proteinaz K (20μg/ml, Chemicon, 21627) uygulandı. Distile su ile yıkanan kesitler endojen peroksidazı bloklamak için metanolde hazırlanan %3’lük H2O2’de 5dk bekletildi. Distile su ve PBS ile çalkalandıktan sonra lam üzerinde kesitlerin etrafı hidrofobik kalem (Zymed, 00-8899) ile çizilerek havuz oluşturuldu ve kesitlere 5dk oda ısısında dengeleme tamponu uygulandı. Daha sonra kesitler 37°C’de terminal deoksinükleotidil transferaz enziminde 1 saat bekletildikten sonra durdurma/yıkama tamponuyla 15 saniye çalkalandı ve oda ısısında 10dk bekletildi. PBS’de 3 kez yıkanan kesitlere antidigoksigenin konjügatı uygulandı ve oda ısısında 30dk tutuldu. Kesitlere 3 kez PBS ile yıkama sonrasında 10dk diamino benzidin (DAB) kromojen solüsyonu (LabioVisn, TA-002-HAC) uygulaması yapıldı. Kesitler distile su ile yıkandıktan sonra 10dk Methyl green uygulanarak zıt boyama yapıldı. Distile sudan hızla geçirilen kesitler %100 N-Butanolden de hızla geçirildi. Dehidrate edilen kesitler 3x2dk toluolde tutulduktan sonra kapatma solüsyonu konarak lamel ile kapatıldı ve ışık mikroskobunda değerlendirmeye alındı. Işık mikroskobunda (Olympus CX31-Japan) incelenerek, bulguların fotoğrafları çekildi. Ayrıca tüm gruplarda TUNEL pozitif hücre sayıları semikantitatif olarak saptandı (Tablo 2). Semikantitatif değerlendirme, aşağıdaki biçimde yapıldı; yok (-), nadir (±), az(+), orta (++), fazla (+++), çok fazla (++++). 29 Biyokimyasal Parametreler Doku homojenizasyonu: Daha sonra örnekler (doku ve serum) oda sıcaklığına getirildi. Doku örnekleri hassas terazi ile tartıldı. Takiben 0,15M fosfat tamponu ile homojenize edilerek % 10’luk homojenatlar elde edildi. Homojenizasyon işlemleri +4°C’de yapıldı. Homojenizasyon işlemi bittikten sonra MDA tayini için hazırlanmış homojenatlar 3000rpm’de 10dk, NO, SOD, Katalaz için hazırlanmış olanlar ise 13000rpm’de 15dk santrifüj edilerek süpernatantlar elde edildi. Nitrik oksit tayin yöntemi: NO, stabil metabolitleri olan nitrit ve nitrat iyonlarının konsantrasyonlarıyla tayin edildi (Roche, Nitric Oxide Colorimetric Assay, 1756281). homejenatta bulunan nitrat, nitrat redüktaz (10U/ml), NADPH (1mM) ve FAD (0,1mM) varlığında nitrite indirgenir. NADPH fazlası piruvat (100mM) ve laktat dehidrogenaz (1500U/ml) etkinliğinde uzaklaştırılarak, ortamdaki total nitrit, Griess reaktifi (%2 sülfanilamid ve %0.2 N-naftil etilendiamin) ile reaksiyona sokulur. Oluşan pembe renkli diazo bileşiği 550nm dalga boyunda okunur. Nitrik oksit standart eğrisi ise 6,5/3,25/1,25/1,625/0,812mg/l konsantrasyonlarındaki potasyum nitrat çözeltileriyle hazırlandı. Bütün grup örneklerinden ve paralel olarak standart çözeltilerinden 50μl kullanılarak Griess yöntemi uygulandı. Kör, standart ve deney tüplerine 90μl distile su, 10μl FAD, 50μl NADPH, 50μl nitrat redüktaz eklenerek karıştırıldıktan sonra 37°C’de 30dk bekletildi. Takiben 3μl laktat dehidrogenaz ve 25μl piruvik asit eklenerek karıştırıldı ve 37°C’de 10dk inkübe edildi. Her tüpe Griess reaktifi eklenerek 37°C’de 10dk inkübe edildi. Spektrofotometrede 550nm dalga boyunda köre karşı absorbansları okunduktan sonra, standart eğri kullanılarak sonuçlar mg/gram yaş doku olarak hesaplandı. Malondialdehit tayin yöntemi: Lipid peroksidasyon son ürünü MDA, asit ve sıcak ortamda tiobarbitürik asid (TBA) ile kırmızı renkli ürün oluşturur. Oluşan bu ürünün absorbansı 535nm’de okunur. Takiben 125μl homojenat 1350μl reaktif (0.25 N HCl + %0.375 TBA + %15 TCA) eklenerek tüplerin ağızları kapatıldı ve 30dk kaynar su banyosunda tutuldu. 1000g’da 10dk santrifüjü takiben süpernatant absorbansı 535nm’de köre karşı okundu. Molar ekstinksiyon katsayısı 1.56 x 105 M-1 x cm-1 kullanılarak hesaplar yapıldı ve sonuçlar mikromol/gram yaş doku olarak verildi (105). 30 Süperoksit dismütaz tayin yöntemi: Ksantin/ksantin oksidaz sistemiyle oluşan süperoksit anyonları, nitroblue tetrazoliumu indirger ve bu indirgenme SOD tarafından inhibe edilir. Reaksiyon karışımı 200ml’lik bir behere hazırlandı: 40ml ksantin (0.3mM) + 20ml EDTA (0.6mM) + 20ml nitroblue tetrazolium (150μM) + 12ml Na2CO3 (400mM) + 6ml sığır serum albumini (1gr/L) konuldu ve pH’sı 10.2’ye ayarlandı. Takiben 0.1ml süpernatant, 1ml reaksiyon karışımına konarak 0.5ml ksantin oksidaz eklendi ve 25°C’de 20dk inkübe edildi. Bu sürenin sonunda tüplere 0.05ml CuCl2 eklendi ve 560nm dalga boyunda formazan oluşumu ölçüldü. Bir ünite SOD aktivitesi, nitroblue tetrazoliumun indirgenme hızını %50 inhibe eden miktar olarak tanımlanır. SOD aktivitesi U/ml olarak hesaplandı (106). Sonuçlar U/gram yaş doku olarak verildi. Katalaz tayin yöntemi: Modifiye Aebi yöntemi kullanıldı. Reaksiyon hızı, 240nm’de hidrojen peroksitin absorbansındaki azalma izlenerek belirlenir. Takiben 0.005ml homojenat + 0.395ml Fosfat Tamponu (pH: 7) + 0.2ml H2O2 karıştırılarak reaksiyon başlatıldı ve 0.dk olarak kabul edilerek absorbans ölçüldü. 30°C’de 5dk inkübe edilerek son absorbans ölçüldü (107). kU/L Aktivite = ∆absorbans/ dk X (600/5) X 1/0.04 şeklinde hesaplandı. İSTATİSTİKSEL ANALİZ İstatistiksel değerlendirme, AXA507C775506FAN3 seri numaralı STATISTICA AXA 7.1 istatistik programı kullanılarak yapıldı. Ölçülebilen verilerin normal dağılıma uygunlukları tek örnek Kolmogorov Smirnov testi ile bakıldıktan sonra normal dağılım göstermediği için gruplar arası kıyaslamalarda Kruskal-Wallis varyans analizi ve sonrası ikili kıyaslamalarda Mann Whitney U testi kullanıldı. Tanımlayıcı istatistikler olarak Median (Min-Max) değerleri ve aritmetik ortalama±standart sapma verildi. Tüm istatistikler için anlamlılık sınırı p<0.05 olarak seçildi. 31 BULGULAR IŞIK MİKROSKOPİK BULGULAR Çalışmamızda; fiksatif grubundaki HE boyalı safen ven kesitleri ışık mikroskobunda incelendiğinde; normal yapıda tunika intima, media ve adventisya görüldü. Endotel hücrelerinin normal yapıda olduğu izlendi. Subendotel katmanın oldukça dar olduğu ayırt edildi. İç elastik membranın girintili çıkıntılı olduğu görülürken düz kas hücreleri ve kollagen lifler normal yapıda seyrediyordu (Şekil 10). Şekil 10. Fiksatif grubuna ait histolojik görünüm (Hematoksilen Eozin, X200) HE boyalı 15 LR grubundaki safen ven kesitleri ışık mikroskobunda incelendiğinde; endotel, subendotel, internal elastik membranın ve kas dokunun oldukça korunduğu ve 32 kontrole yakın bir yapı sergilediği dikkati çekti. Bununla birlikte endotel hücrelerinde kontrole göre çok hafif de olsa bir şekil bozukluğu ve subendotelde tek tük sitoplazmik vakuoller görülmeye başlandı (Şekil 11). Şekil 11. 15 LR grubuna ait histolojik görünüm (Hematoksilen Eozin, X200) HE boyalı 15 SF grubundaki safen ven kesitleri ışık mikroskobunda incelendiğinde; endotel hücrelerindeki düzensizliğin ve subendotel tabakadaki sitoplazmik vakuollerinin sayısının 15 LR grubuna göre daha da arttığı tespit edildi (Şekil 12). Şekil 12. 15 SF grubuna ait histolojik görünüm (Hematoksilen Eozin, X200) 33 HE boyalı 45 LR grubundaki safen ven kesitleri ışık mikroskobunda incelendiğinde; endotelyal yüzeyde yer yer kopmalar olduğu ve normal oval yapıda olan endotel hücre şekillerinin yerini poligonal, düzensiz yapıya bıraktığı saptandı. Subendotelyal tabakadaki sitoplazmik vakulollerin sayısınında iyice arttığı görüldü. Ayrıca subendotelyal tabakada genişleme gözlendi (Şekil 13). Şekil 13. 45 LR grubuna ait histolojik görünüm (Hematoksilen Eozin, X200) HE boyalı 45 SF grubundaki safen ven kesitleri ışık mikroskobunda incelendiğinde; endotelyal yüzeyde kopmalar ve ayrılmalara bağlı olarak bölgesel endotel hücre kaybı belirgindi. Dökülen bazı endotel hücrelerine ise subendotel tabakada rastlandı. Mevcut endotel hücre şekillerinin 45 LR grubuna göre daha da bozulmuş olduğu saptandı. Ayrıca subendotelyal tabakadaki sitoplazmik vakulollerin sayısının 45 LR grubuna göre daha da arttığı dikkati çekti. Subendotelyal tabakanın kalınlığının da oldukça artmış olduğu tespit edildi. Subendotel katmanda kollagen liflerde de artma olduğu izlendi (Şekil 14). 34 Şekil 14. 45 SF grubuna ait histolojik görünüm (Hematoksilen Eozin, X200) İMMÜNOHİSTOKİMYASAL BULGULAR Endotelyal Nitrik Oksit Sentaz Fiksatif grubuna ait safen ven dokusunda yapılan incelemelerde, endotel hücrelerinde zayıf bir eNOS pozitif reaksiyonun olduğu gözlendi (Şekil 15). Şekil 15. Fiksatif grubuna ait eNOS immünboyanması. Ok: Endotel hücrelerindeki eNOS pozitif immünreaktivite (İmmünoperoksidaz, hematoksilen zıt boyaması, X400) 35 Yapılan incelemelerde 15 LR grubuna ait safen ven dokusunda, endotel hücrelerindeki eNOS pozitivitesinin hafif olmakla birlikte fiksatif grubuna göre artmış olduğu görüldü (Şekil 16). Şekil 16. 15 LR grubuna ait eNOS immünboyanması. Ok: Endotel hücrelerindeki eNOS pozitif immünreaktivite (İmmünoperoksidaz, hematoksilen zıt boyaması, X400) Yapılan incelemelerde 15 SF grubuna ait safen ven dokusunda, endotel hücrelerinde 15 LR grubuna göre eNOS pozitivesinde artış olduğu saptandı (Şekil 17). Şekil 17. 15 SF grubuna ait eNOS immünboyanması. Ok: Endotel hücrelerindeki eNOS pozitif immünreaktivite (İmmünoperoksidaz, hematoksilen zıt boyaması, X400) 36 Yapılan incelemelerde 45 LR grubuna ait safen ven dokusunda, endotel hücrelerinde güçlü bir eNOS pozitivitesi dikkati çekti (Şekil 18). Şekil 18. 45 LR grubuna ait eNOS immünboyanması. Ok: Endotel hücrelerindeki eNOS pozitif immünreaktivite (İmmünoperoksidaz, hematoksilen zıt boyaması, X400) Yapılan incelemelerde 45 SF grubuna ait safen ven dokusunda ise, 45 LR grubuna göre endotel hücrelerindeki eNOS pozitivitesinin daha da artmış olduğu gözlendi (Şekil 19 ve Tablo 3). Şekil 19. 45 SF grubuna ait eNOS immünboyanması. Ok: Endotel hücrelerindeki eNOS pozitif immünreaktivite (İmmünoperoksidaz, hematoksilen zıt boyaması, X400) 37 Tablo 3. Tüm gruplar arasındaki endoteliyal nitrik oksit sentaz ve CD-34 immunreaktivitelerinin yoğunluğunun semikantitatif olarak değerlendirmesi Fiksatif 15 LR 15 SF 45 LR 45 SF eNOS ± + ++ +++ ++++ CD-34 ± + ++ +++ ++++ eNOS : Endoteliyal nitrik oksit sentaz, LR : Laktatlı ringer, SF: Serum fizyolojik. Semikantitatif değerlendirme: yok (-), zayıf (±), hafif (+), orta (++), güçlü (+++), çok güçlü (++++). CD-34 Fiksatif grubuna ait safen ven dokusunda yapılan incelemelerde, endotel hücrelerinde zayıf bir CD-34 reaktivitesinin olduğu gözlendi (Şekil 20). Şekil 20. Fiksatif grubuna ait CD-34 immünboyanması. Ok: Endotel hücrelerindeki CD-34 pozitif immünreaktivite (İmmünoperoksidaz, hematoksilen zıt boyaması, X400) 38 Yapılan incelemelerde 15 LR grubuna ait safen ven dokusunda, endotel hücrelerindeki CD-34 pozitivitesinin hafif olmakla birlikte fiksatif grubuna göre artmış olduğu saptandı (Şekil 21). Şekil 21. 15 LR grubuna ait CD-34 immünboyanması. Ok: Endotel hücrelerindeki CD-34 pozitif immünreaktivite (İmmünoperoksidaz, hematoksilen zıt boyaması, X400) Yapılan incelemelerde 15 SF grubuna ait safen ven dokusunda, endotel hücrelerinde 15 LR grubuna göre CD-34 pozitivesinde artış olduğu gözlendi (Şekil 22). Şekil 22. 15 SF grubuna ait CD-34 immünboyanması. Ok: Endotel hücrelerindeki CD-34 pozitif immünreaktivite (İmmünoperoksidaz, hematoksilen zıt boyaması, X400) 39 Yapılan incelemelerde 45 LR grubuna ait safen ven dokusunda, endotel hücrelerinde güçlü bir CD-34 pozitivitesi görüldü (Şekil 23). Şekil 23. 45 LR grubuna ait CD-34 immünboyanması. Ok: Endotel hücrelerindeki CD-34 pozitif immünreaktivite (İmmünoperoksidaz, hematoksilen zıt boyaması, X400) Yapılan incelemelerde 45 SF grubuna ait safen ven dokusunda ise, endotel hücrelerindeki CD-34 pozitivitesinin 45 LR grubuna göre daha da artmış olduğu tesbit edildi (Şekil 24 ve Tablo 3). Şekil 24. 45 SF grubuna ait CD-34 immünboyanması. Ok: Endotel hücrelerindeki CD-34 pozitif immünreaktivite (İmmünoperoksidaz, hematoksilen zıt boyaması, X400) 40 Tablo 4. Tüm gruplar arasındaki endoteliyal nitrik oksit sentaz ve CD-34 immunreaktivitelerinin yoğunluğunun semikantitatif olarak değerlendirmesi Fiksatif 15 LR 15 SF 45 LR 45 SF eNOS ± + ++ +++ ++++ CD-34 ± + ++ +++ ++++ eNOS : Endoteliyal nitrik oksit sentaz, LR : Laktatlı ringer, SF: Serum fizyolojik. Semikantitatif değerlendirme: yok (-), zayıf (±), hafif (+), orta (++), güçlü (+++), çok güçlü (++++). TUNEL BOYAMA BULGULARI Fiksatif grubuna ait safen ven dokusunda yapılan incelemelerde, nadir sayıda TUNEL pozitif endotel hücresi görüldü (Şekil 25). Şekil 25. Fiksatif grubuna ait TUNEL boyanması. Ok: TUNEL pozitif endotel hücreler (X400) 41 Yapılan incelemelerde 15 LR grubuna ait safen ven dokusunda, az sayıda TUNEL pozitif endotel hücresi gözlendi (Şekil 26). Şekil 26. 15 LR grubuna ait TUNEL boyanması. Ok: TUNEL pozitif endotel hücreler (X400) Yapılan incelemelerde 15 SF grubuna ait safen ven dokusunda, orta sayıda TUNEL pozitif endotel hücresi tespit edildi (Şekil 27). Şekil 27. 15 SF grubuna ait TUNEL boyanması. Ok: TUNEL pozitif endotel hücreler (X400) 42 Yapılan incelemelerde 45 LR grubuna ait safen ven dokusunda, çok sayıda TUNEL pozitif endotel hücresi saptandı (Şekil 28). Şekil 28. 45 LR grubuna ait TUNEL boyanması. Ok: TUNEL pozitif endotel hücreler (X400) Yapılan incelemelerde 45 SF grubuna ait safen ven dokusunda ise, çok fazla sayıda TUNEL pozitif endotel hücresi gözlendi (Şekil 29 ve Tablo 4). Şekil 29. 45 SF grubuna ait TUNEL boyanması. Ok: TUNEL pozitif endotel hücreler (X400) 43 Tablo 5. Tüm gruplar arasındaki TUNEL pozitif hücre sayılarının semikantitatif olarak değerlendirmesi Fiksatif ± TUNEL 15 LR + 15 SF ++ 45 LR +++ 45 SF ++++ LR : Laktatlı ringer, SF: Serum fizyolojik. Semikantitatif değerlendirme: yok (-), nadir (±), az(+), orta (++), fazla (+++), çok fazla (++++). BİYOKİMYASAL PARAMETRELERİN BULGULARI Çalışmanın verileri STATISTICA AXA 7.1 istatistik programı kullanılarak yapıldı. Ölçülebilen verilerin normal dağılıma uygunlukları tek örnek Kolmogorov Smirnov testi ile bakıldıktan sonra normal dağılım göstermediği için gruplar arası kıyaslamalarda KruskalWallis varyans analizi ve sonrası ikili kıyaslamalarda Mann Whitney U testi kullanıldı. Tanımlayıcı istatistikler olarak Median (Min-Max) değerleri ve aritmetik ortalama±standart sapma verildi. Tüm istatistikler için anlamlılık sınırı p<0.05 olarak seçildi (Tablo 6). Tablo 6. Grup özelliklerine göre istatistikler olarak Median (Min-Max) değerleri ve aritmetik ortalama±standart sapma Kontrol Grubu 15 LR Grubu 15 SF Grubu 45 LR Grubu 45 SF Grubu P* (no:10) (no:10) (no:10) (no:10) (no:10) Değişken SS SS SS SS SS Ortanca (min- Ortanca (min- Ortanca (min- Ortanca (min- Ortanca (minmax) max) max) max) max) 0,018** 6,68 3,21 ! 9,53 1,81 10,73 2,23 9,74 2,20 8,47 2,02 NO 8,87 5,73 9,27 10,64 8,84 (4,75-11,59) (3,41-13,51) (7,38-12,98) (7,33-15,13) (7,53-14,70) 0,066 1700,44 1632,01 1626,29 1372,43 1449,20 336,10 426,84 472,38 426,84 266,72 KAT 1672,19 1548,98 1738,98 1299,85 1478,81 (1204,59(946,16(629,28(926,40(1103,452391,84) 2608,69) 2195,09) 2500,17) 1895,77) 0,232 19,25 8,49 21,97 4,15 20,98 3,48 17,89 7,12 15,80 8,53 SOD 17,38 20,94 21,09 19,08 14,89 (6,22-33,85) (17,46-31,64) (14,13-26) (4,74-28,35) (5,04-30,97) 0,342 240,43 187,69 94,87 265,22 172,00 68,85 295,73 MDA 134,26 169,32 140,46 141,31 185,46 209,74 (74,48-284,22) (87,78-355,65) 239,30 264,87 (81,30-444,95) (93,25-599,49) (76,61-598,66) NO: Nitrik oksit, Kat: Katalaz, SOD: Süperoksit dismütaz, MDA: Malondialdehit, SS: Standart sapma, LR : Laktatlı ringer, SF: Serum fizyolojik, *: Kruskal-Wallis Varyans analizi, **: P<0,05 istatistiksel yönden anlamlı fark, !: Kontrol grubu, 15 SF grubu ile kıyaslandığında P<0,05. 44 Nitrik oksit düzeyi bakımından gruplar arasında istatistiksel yönden anlamlı bir fark olup, yapılan ikili kıyaslamalarda (Mann Whitney U testine göre) kontrol grubu ile 15 SF, 15 LR, 45 LR grupları ve 15 SF ile 45 SF grupları arasındaki fark istatistiksel yönden anlamlıydı (p<0,05) (Şekil 30). Katalaz düzeyi bakımından gruplar arasında istatistiksel yönden anlamlı bir fark (P>0,05) olmamasına rağmen kontrol grubunda diğer gruplara göre KAT düzeyi daha yüksektir (Şekil 31). Süperoksit dismütaz düzeyi bakımından gruplar arasında istatistiksel yönden anlamlı bir fark olmamasına rağmen (p>0,05), yapılan ikili kıyaslamalarda 15 LR ile 45 SF grupları arasında istatistiksel yönden anlamlı bir fark olup (p<0,05), 15 LR grubunda 45 SF grubuna göre klinik olarak SOD düzeyi daha yüksektir (Şekil 32). Malondialdehit düzeyi bakımından gruplar arasında istatistiksel yönden anlamlı bir fark olmamasına rağmen (p>0.05), 15 LR ve 45 LR grupları arasında yapılan ikili kıyaslamada anlamlı bir fark olup (p<0,05), 45 LR grubunda 15 LR grubuna göre MDA düzeyi klinik olarak daha yüksektir (Şekil 33). 14 12 ** 10 kontrol 8 * SF15 LR15 6 SF45 4 LR45 2 0 kontrol SF15 LR15 SF45 LR45 SF: Serum fizyolojik, LR : Laktatlı ringer, *: kontrol grubu SF15, LR15 ve LR45 ile kıyaslandığında p<0.05, **: SF15 grubu SF45 ile kıyaslandığında p<0.05. Şekil 30. Nitrik oksit düzeyi 45 2500 2000 kontrol 1500 SF15 LR15 1000 SF45 LR45 500 0 kontrol SF15 LR15 SF45 LR45 SF: Serum fizyolojik, LR : Laktatlı ringer. Şekil 31. Katalaz düzeyi 30 25 * 20 kontrol SF15 15 LR15 SF45 10 LR45 5 0 kontrol SF15 LR15 SF45 LR45 SF: Serum fizyolojik, LR : Laktatlı ringer, *: LR15 grubu ile SF45 grubu kıyaslandığında p<0.05. Şekil 32. Süperoksit dismütaz düzeyi 46 600 500 400 kontrol SF15 300 LR15 * SF45 200 LR45 100 0 kontrol SF15 LR15 SF45 LR45 SF: Serum fizyolojik, LR : Laktatlı ringer, *: LR15 grubu ile LR45 grubu kıyaslandığında p<0.05. Şekil 33. Malondialdehit düzeyi 47 TARTIŞMA Kalp cerrahisi, Gibbon ve arkadaşlarının kalp-akciğer makinasını bulmaları ile birlikte hızlı bir gelişim göstermiş ve günümüzde birçok merkezde başarı ile uygulanmaya başlanmış olup, gelişimini hala büyük bir hızla sürdürmektedir. Kalp cerrahisinde aortokoroner bypass operasyonları en sık yapılan operasyonlardandır. KABG operasyonlarında amaç hastanın iskemik kalp bölgesine yeterli kan akımını sağlayarak hastanın yaşam kalitesini düzeltmek ve yaşam süresini uzatmaktır. Değişik cerrahi yöntemler ve farmakolojik ajanların kullanımına rağmen koroner arter bypass cerrahisinde ven greft açık kalma oranı nispeten zayıftır ve önemli bir klinik sorun olmaya devam etmektedir. Koroner bypass cerrahisinin başarısı bütün vasküler girişimlerde olduğu gibi greftlerin uzun süreli açık kalmalarına bağlıdır. Bu nedenle hedef en uzun süre açık kalacak greftlerin seçimidir. KABG ameliyatlarında greft seçiminde hastanın yaşı, klinik durum, ″bypass″ yapılacak damarlar, greftin kullanılabilirliği ile birlikte cerrahın deneyimi de belirleyici olmaktadır. Safen ven; çapının geniş olması, anatomik olarak uzun seyretmesi, spazm olmaması ve çıkarılmasındaki kolaylık nedeniyle koroner bypass cerrahisinde en çok kullanılan greftlerin başında gelmektedir. Safen ven ayak bileği seviyesinde medial malleolun önünde hazırlanıp, kanüle edilerek düşük bir basınç (<100mmHg) ile şişirilir ve çevreleyen doku venin üzerinde kalmayacak şekilde diseksiyon yapılır. İşlem sırasında endotel hasarını önlemek için ven sadece adventisyadan atravmatik vasküler bir penset ile tutulur. Yan dallar için mümkün olduğunca klip tercih edilmeyip ven hafif şişirilmiş halde duvara 1mm mesafede bağlanır. Yapılan çalışmalarda aortokoroner bypass greftlerin cerrahi girişim sonrası ilk 3 ayda tıkanma hızları %7–12, birinci yılda %10–20 arasındadır ve yıllık %2–5 oranında ilerler. 48 Beşinci yılda aortokoroner greftlerin %25’i, onuncu yılda ise %35’i tıkanır (7). Postoperatif birinci ayda trombotik tıkanma greft yetersizliğinin ana sebebidir. Cerrahi esnasında olan endotel hücre kaybı ve medial hasar ile arteriyelize vendeki hemodinamik değişiklikler bu olaya katkıda bulunur. Venin intimasında düz kas hücrelerinin ve ektrasellüler matriksin artması olarak tanımlanan neointimal hiperplazi ilk bir yılda venöz greftlerde olan en önemli sorundur. İntimal hasarın düz kas hücre proliferasyonunu artırdığı tespit edilmiştir. Birinci yıldan sonra ise greft yetersizliğinin ana sebebi aterosklerozdur (108,109). Safen ven greft yetersizliğinine yol açan birçok faktör mevcuttur. Venin arteriyel basınca maruz kalması ve ven duvarına kan akımını sağlayan vazovazorumların kesintiye uğraması önleyemeyeceğimiz faktörlerdendir. Bunun yanında veni uygun solüsyonlarla şişirmek ve bekletmek, hazırlama esnasında aşırı distansiyondan kaçınmak da önlenebilir faktörlerdendir. Aşırı distansiyon ven duvarında dejeneratif değişikliklere ve endotel hasarına sebep olmaktadır. Oluşan endotel hasarı o bölgede trombosit ve fibrin birikimi ile tromboza zemin hazırlar. Aynı zamanda trombositlerden açığa çıkan büyüme faktörü subintimal dokuda düz kas hücre proliferasyonuna ve lümen çapının daralmasına sebep olur. Bu olaylar uzun sürede ven duvarında lipid birikimini arttırarak greft aterosklerozunu hızlandırır (108,110). 1999 yılında Souza ve ark. (111,112) yaptıkları bir çalışmada safen venin geleneksel yöntemle çıkartılması, aralıklı kesilerle çıkartılması ve çevre destek dokusuyla birlikte çıkartılmasını karşılaştırmışlardır. Greft endotelinde en iyi korunmayı, çevre destek dokularla birlikte safen vene temas edilmeden yapılan çıkartma yönteminin sağladığını ve bu yolla endotel bütünlüğünün tam olduğunu savunmuşlardır. Ancak bu yöntem, yüzeysel ve fibrotik venleri olan aşırı kilolu hastalarda uygulanabilir değildir. Ayrıca çevre destek doku ile çıkartma sırasında safen sinir hasarı ve buna bağlı olarak ameliyat bölgesinde hissizlik ve uyuşukluk bu yöntemin eksik yönleri olarak görülmektedir. Safen ven grefti hazırlama yöntemleri arasında en yaygın ve kolay uygulananı geleneksel yöntem diye tarif edilen safen ven trasesinin uzun insizyonla açılması ve safen venin yan dallarının bağlanarak yatağından çıkarılmasıdır. Ancak bu yöntemle operasyon sırasında vene yapılan travma tamamen ortadan kaldırılamamaktadır. Greft hazırlama esnasında yapılan germe, çekme, yüksek basınçla şişirerek yan dallardan olan kaçakların tespiti işlemleri ve uygun olmayan şartlarda bekletme greftte intimal hasara yol açmakta ve oluşan bu hasar da o bölgede vazospazma, trombosit kümelenmesine, subendotelyal fibröz hiperplazi gelişimine ve sonuçta greftin tıkanmasına neden olmaktadır (38). 49 Kliniğimizde safen ven çıkartılırken hassas davranılmasına karşın klasik teknikle hazırlandığı için anostomoz aşamasına kadar; tutma ve çekme nedeniyle mekanik travmadan, vazovazorumların ortadan kaldırılmasıyla hipoksiden, kaçakları kontrol etmek ve vazospazmı yenmek amacıyla şişirildiği için basınçtan (şişirme esnasında hasarı önlemek için basıncın 100mmHg altında tutulması istenirken vazospazmı yenmek için 480mmHg’lık basıncın gerektiği belirtilmiştir), bekleme solüsyonunda hipoksinin devam etmesinden, anastomoz aşamasında tekrar tutma ve çekmeye bağlı mekanik travmadan etkilenmektedir (113,114). Bizim çalışmamızda; bu biyomekanik hasar elde ettiğimiz safen ven örneklerinde, safen ven kesitleri ışık mikroskobunda incelendiğinde; endotelyal yüzeyde kopmalar ve ayrılmalara bağlı olarak bölgesel endotel hücre kaybı belirginliği, dökülen bazı endotel hücrelerinin subendotel tabakada tespit edilmesi olarak saptanmıştır. Ayrıca subendotelyal tabakadaki sitoplazmik vakuollerin sayısının arttığı da dikkati çekmektedir. Subendotelyal tabakanın kalınlığının da oldukça artmış olduğu tesbit edilmiş ve subendotel katmanda kollagen liflerde de artma olduğu izlenmiştir. Koroner bypass cerrahisinde safen ven grefti hazırlanırken oluşan spazmın giderilmesi için uygulanan mekanik distansiyon sırasındaki basınca bağlı endotel hasarı gelişebilmektedir. Basıncın 100mmHg üzerinde tutulduğu uygulamalarda önemli derecede endotel hasarı oluştuğu, 100mmHg altındaki uygulamalarda ise hasarın daha az olduğu belirlenmiştir (101). Safen venin çıkarılması sırasında oluşan spazmın nedeni tam olarak anlaşılamamış olmasına rağmen en olası nedeni diseksiyon ve müdahale sırasında mekanik uyarıya karşı düz kasların cevabıdır. Farmakolojik olarak değerlendirildiğinde ise vazokonstrüktör etkisi, trombositlerden Prostaglandin, endotelyumlardan endotelin-1 ve dolaşan konstrüktörler, anjiyotensin-2, katekolaminler ve vazopressinlerden kaynaklanmaktadır. Ven greftlerinin oklüzyonlarının mekanizması tam olarak anlaşılmamasına rağmen, çıkarılma sırasında spazmın geri döndürülmesinde yüksek basınç kullanılması oklüzyonu meydana getiren faktör olarak gösterilmesini destekleyen birçok kanıt vardır. Aşırı basınçla şişirmenin anlık etkisi endotelyum kaybı ve media hasarıdır (53,115). Gecikmiş etkisi ise ven duvarındaki lipid alımının artması ve açık kalma oranının azalmasıdır (9). Gundry ve ark. (116) 1980 yılında yaptıkları çalışmada safen ven hazırlama sırasında soğuk kan ve salin ile ılık kan ve salin solüsyonlarını ve greftlere bu solüsyonlarla 100mmHg ve 300mmHg basınç uygulamasını endotel hasarı yönünden karşılaştırmışlardır. Ilık kanda bekletilen greftlerde orta derecede endotel hasarı olurken ılık salinde bekletilenlerde ağır endotel hasarı tespit etmişler, soğuk kanın ise endoteli iyi koruduğunu görmüşlerdir. 300mmHg basınçla ılık salin solüsyonunun 50 endotelde geri dönüşsüz ağır hasar yarattığını, 100mmHg basınçla soğuk kanın ise endoteli daha iyi koruduğunu tespit etmişlerdir. Biz de bu çalışmamızda safen vene basınç uygulanması endotel hasarına sebep olduğu için, ven parçalarını basınçla şişirmeden çalışmamıza dahil ettik. Ven greft trombozunun ve neointimal hiperplazinin önlenmesinde greftin koruma solüsyonlarında ne kadar süre bekletileceği ve solüsyonun içeriğinin ne olacağı da tartışmalıdır. Heparinize tam kan ve elektrolit solüsyonlarında; serum fizyolojik ve laktatlı ringer gibi bekletilen safen vende endotel hücrelerinde morfolojik ve fonksiyonel bozulma tespit edilmiş olup fonksiyonel bozulmanın bir süre devam ettiği gösterilmiştir (109). Otolog kanın safen ven için iyi bir preservasyon solüsyonu olduğu yönünde yayınlar bulunmaktadır. Ven endoteli lümende bulunan kandan oksijenlenmektedir, bunun için safen venin oksijensiz sıvılar içinde saklanmasının endotele hasar verdiği ve arteriyelize kanın ven greftleri için en iyi ortamı oluşturduğu bildirilmektedir. Safen vene basınç uygulanması endotel hasarına sebep olduğu için, basınçla şişirilmemiş ve kanda bekletilen safen venlerin iyi sonuçlar verdiği bulunmuştur (117-119). Bununla beraber kan trombosit, fibrin, lökosit ve diğer protrombotik maddelerden zengindir. Kan ile hazırlanan ven endotelinde fibrin, trombosit ve lökosit agregatlarının daha fazla olduğu gösterilmiştir (120). Kandaki şekilli elemanların, endoteldeki hasarlı bölgelerle teması tromboza sebep olabilir. LR ve diğer dengeli elektrolit solüsyonlarının kullanımının endotel korunmasında sonuçları daha iyidir (117,120). Bu gibi solüsyonların kullanımı ile kanın potansiyel yan etkilerinden de kaçınılmış olunur. Sonuç olarak; ideal greft hazırlanma yöntemini tespit etme amacı ile yalnız kan ve serum fizyolojik, ya da vazodilatörler çeşitli basınçlarda kullanılarak araştırmalar yapılmıştır (110,121). Kan ve serum fizyolojik solüsyonunda bekletilen venlerde yapılan çalışmalarda, kanda bekletilen venlerde serum fizyolojik grubuna göre daha çok duvar kasılması ve endotel hücre kaybı meydana geldiği, serum fizyolojik grubunda ise damar gevşemesinin daha iyi olduğu tespit edilmiştir (122). Saklama solüsyonlarının sıcaklığının ven greft koruması üzerine etkisine yönelik detaylı çalışmalar yapılmıştır (109,122). Bu çalışmaların tümünün sonuçları normotermik veya oda sıcaklığında ven greftini bekletmeyi desteklememesine rağmen, ven greftinin +4°C'de bekletilmesinin endotelde hasar oluşturduğu konusunda fikir birliği vardır. Solberg ve ark. (123) venin +4°C solüsyonda bekletilmesi ile endotelyal hücre disfonksiyonunda önemli artış olduğunu göstermişlerdir. Çalışmalarında endotel hücrelerinde +4°C'de %18, 20°C'de ise %4 kayıp gözlemlemişlerdir. Bu çalışmadan normotermik solüsyonlarla endotel 51 hasarının daha az olduğu görülmektedir. Lawrie ve ark. (118) da normotermik veya oda sıcaklığında dengeli elektrolit solüsyonlarının kullanımı ile bu sonucu destekleyen sonuçlar elde etmişlerdir. Biz de bu çalışmamızda, hipotermik sıcaklıkta endotel disfonksiyonunun gelişmesi üzerine, ven parçalarını oda sıcaklığında çalışmamıza dahil ettik. Tüm bu literatürlere bakıldığında SF ve LR solusyonlarının en iyi saklama solusyonları olduğu düşünülmekte fakat birbirlerine karşı üstünlüklerine yönelik yeteri kadar çalışma olmadığı görülmektedir. Biz de çalışmamızda bu literatür bilgileri ışığında, doğru saklama solüsyonunu belirlemek için oda sıcaklığında heparinli SF ve LR solüsyonlarını kullandık ve safen venlerinin solüsyonlarda tolere edilebilir bekleme sürelerini saptayabilmek amacıyla 15 ve 45dk beklettik. Çalışmamızda histopatolojik olarak; LR grubunun, SF grubuna göre kontrol grubuna en yakın hücresel yapı bulguları gösterdiğini tespit ettik. Literatürde safen venin saklama solüsyonlarında 1 saat bekletilmesinin iyi tolere edildiği gösterilmiştir (117). Biz çalışmamızda hücresel bozulmanın ilk 15dk’da, 45dk’ya göre kontrol grubu ile karşılaştırıldığında daha tolere edilebilir olduğunu saptadık. 1990 yılında Barner (117); yapmış olduğu bir çalışmada serum fizyolojiğin asit pH'ında olduğu için endotelyal disfonksiyona, hücre kaybına, ödeme sebep olduğunu ve bunların ven duvarında geç dönemde patolojik değişikliklere yol açabileceğini bildirilmiştir. Biz de bu çalışma ile uygun olarak kendi çalışmamızda SF grubundaki HE boyalı safen ven kesitleri ışık mikroskobunda incelendiğinde; endotel hücre kaybı, subendotelyal tabakadaki sitoplazmik vakuollerin arttığı ve ödem oluştuğu, subendotel katmanda kollagen liflerde de artma olduğunu tespit ettik. Fakat bu bozulmanın, LR grubunda daha erken sürelerde daha tolere edilebilir olduğunu saptadık. Tüm çalışmalarda ortaya konmuş olmasına rağmen vasküler endotel harabiyetinin nedenleri tam olarak bilinememektedir. Çeşitli teorilerin geliştirildiği bu konuda intrinsik venöz duvar anormallikleri vasküler endotel harabiyetinin en önemli sebebi olarak gösterilmektedir. Bu yapısal anormallikler; incelmiş ve düzensizleşmiş düz kas tabakası, fibröz dejenerasyona uğramış media tabakası, şişmiş ve helikal kırılmış kollajen fibriller olarak tanımlanmıştır. Damarların tunika mediasındaki ekstraselüler matriks, elastik lameller ve kollajen fibrillerin ven histopatolojisinde önemli role sahip olduğu tespit edilmiştir (124). Yapılan çalışmalarda duvar dejenerasyonunda bu dağılımının homojen olmadığı, bazı segmentlerin kalınlaşmış ve fibrotikleşmişken bazı segmentlerin anevrizmalaştığı görülmüştür. Bu sonuçlar venlerin elastin, kollajen ve düz kas hücre içeriğiyle ilgili yapılan morfolojik ve histokimyasal çalışmalarda da saptanmıştır (125). Günümüzde yapılan 52 araştırmalar vasküler endotel harabiyeti ve histopatolojisi için yeni ve oldukça önemli bilgiler vermektedir. Normal vasküler duvar gelişimi ve yeniden yapılanmasını etkileyen doku kitle ve yapısını düzenleyen programlanmış hücre ölümü olarak tanımlanan “Apoptozis’’ güncel konuların başında gelmektedir. Venlerde apoptotik ölümün vasküler yapının ve tonusunun ayarlanmasında büyük önemi olan vasküler düz kas hücreleri ile ilişkili olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. Dejenere safen ven greftlerin hücrelerinde de apoptozis gösterilmiş, böylece intimal lezyonlardaki vasküler düz kas hücrelerinin turnoverinden apoptozisin sorumlu olabileceği ve meydana gelen hücresel azalmaya apoptotik vasküler düz kas hücre ölümünün katkıda bulunabileceği gösterilmiştir (126). Ayrıca apoptozis endotelyal hücreler ve inflamatuar yanıt hücreleri gibi diğer hücre popülasyonunda da tespit edilmiştir (127). Ven duvarı hücrelerinin disfonksiyonunun hücre siklusu, apoptozisin deregülasyonuna bağlı olması muhtemeldir. Çünkü apoptozis hücre sayısının korunmasında ve doku hemostazında majör bir rol oynar, bu da ven duvarındaki hücre turnoverine etki eder. Apoptozis ile ilgili birçok çalışma yapılmış ve bu çalışmalarda özellikle vasküler hücrelerin yaşama yeteneğinin moleküler düzeyde proapoptotik ve antiapoptotik sinyaller arasındaki denge ile belirlendiği gösterilmiştir. Bu olaylar bir takım gen familyaları aracılıklıdır ve bunlardan en önemlisi bcl-2 familyasıdır. Bcl-2 nin overekspresyonu birçok hücre tipinde apoptozise karşı koruyucu olup bcl-2’nin apoptozis inhibisyonuyla ilişkili olduğu tespit edilmiştir. Anjiyografik olarak % 70’in üzerinde tıkanıklık tespit edilen ve tekrar koroner arter bypass ameliyatı geçiren 14 hastanın safen ven greft duvarında Tunel metodu ve immunohistokimyasal antikorlar kullanılarak proapoaptotik (Bax, p53, CPP32) ve antiapoptotik (Bcl-2) proteinler gösterilmeye çalışılmıştır. Safen ven greftin aterosklerotik alanında proapoptotik (Bax, p53, CPP32) proteinler daha fazla tespit edilmiş ancak ultrastruktural analizlerde apoptozisin özelliklerini açığa çıkarmada yetersiz kalınmıştır. Ayrıca bu alanda hücre ölümü sıklıkla görülürken, Tunel metoduyla bcl-2 negatif korelasyon gösterilmiştir. Safen venin nonaterosklerotik alanında ise Tunel metoduyla hem antiapoptotik hem de proapoptotik proteinler gösterilmiştir (128). Jarzembowski ve ark. (129) safen venin implantasyon öncesi bekletildiği solüsyonun endotelial ve düz kas hücrelerinde apoptozise yol açtığını, piruv at preserve solüsyonlarla bu olayın çok daha az olduğunu göstermişlerdir. Rat aortik düz kas hücreleri ve domuz koroner endotel hücreleri ile yapılan bir invitro çalışmada, papaverin ile 1 saatlik inkubasyon sonrası hem düz kas hücreleri ve hem de endotelyal hücrelerinde Tunel metoduyla boyanmış apoptotik hücre sayılarında belirgin artış 53 gösterilmiştir (130). Biz de bu çalışmamızda; 15dk ve 45dk, LR ve SF solüsyonlarında beklettiğimiz safen ven örneklerinin, endotel ve düz kas hücrelerinde Tunel metoduyla boyanmış apoptotik hücre sayılarında geçen süre ile birlikte belirgin bir artış olduğunu gözlemledik. Sağlıklı vasküler endotelde konstitütif NO sentezi, arteryel damarlarda aktif vazodilatasyonun sürdürülmesinde, damar duvarının akışkanlığını sağlamakta ve plateletlerin ve lökositlerin endotele yapışmasını önlemektedir. Mevcut çalışmalarda eNOS yolundaki bir bozukluk, aterogenezdeki en erken olaylardan birisidir (131-134). Kown ve ark. (88) Larginin ile venöz greftlerde NO seviyesinin artışını ve neointimal hiperplazinin azaldığını göstermişlerdir. Biz de çalışmamızda immünohistokimyasal olarak safen ven endotelinde iskemi süresi ile doğru orantılı olarak eNOS tutulumunun arttığını ve biyokimyasal olarak da NO düzeyi bakımından gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğunu tespit ettik (p<0,05). Çalışmalar kemik iliği kaynaklı endotelyal progenitör hücrelerin, vasküler hasar sonrası endotelyal rejenerasyon ve aterosklerotik plak progresyonunun inhibisyonunda önemli olduğunu göstermiştir. CD-34 hücreleri olarak tanımlanan dolaşan EPH sayısının sağlıklı insanlarda endotel fonksiyonlarıyla EPH sayısı arasında negatif bir korelasyon bulunduğu saptanmıştır (15). Hayvan çalışmalarında EPH’in anjiyogenez ile postnatal vaskülogenezde rol oynadığı gösterilmiştir. Lev ve ark. (135); ST elevasyonsuz miyokard infarktüsünden bir hafta sonra perkutan koroner girişim yapılacak 20 hastada kollateral gelişimi olanlarda EPH sayısını kollaterali olmayan gruba göre daha yüksek bulmuşlardır. Miyokard iskemisi olan hastalarda yapılan çalışmalarda iskeminin kemik iliğinden EPH mobilizasyonunu indüklediği görülmüştür (136). Ayrıca bilinen koroner arter hastalığı olanlarda tek epizotluk egzersiz ilişkili iskeminin bile olayı takiben 24-48 saat boyunca periferik kandaki EPH sayısında geçici olarak yükselmeye neden olduğu gösterilmiştir (137). Kollateral gelişiminde etkili olan en önemli faktörlerden biri de hipoksik stimülasyondur. Yaygın kollateral gelişimine neden olacak hipoksik stimülasyon aynı zamanda periferik kanda EPH sayısının artışına neden olabilir (135). Biz çalışmamızda immünhistokimyasal olarak safen ven dokusunda yapılan incelemelerde, endotel hücrelerindeki CD-34 pozitivitesinin kontrol grubuna göre daha da artmış olduğunu gözlemledik. İlk 15 dakikada LR grubundaki artışın klinik olarak daha kabul edilebilir olduğunu tespit ettik. Yapılan çalışmalarda ve bizim çalışmamızda da ortaya konulduğu gibi safen ven greftin çıkartılırken; tutulması, çekilmesi, spazmı yenmek ve kaçakları kontrol etmek 54 amacıyla şişirilmesi, uygunsuz solüsyonlarda bekletilmesi mekanik ve hipoksik hasara neden olmaktadır. Thatte ve Khuri (138) standart bekleme solüsyonu içindeki safen ven’de dakikalar içinde endotel hücrelerinin kötüleşmeye başladığını bir saat sonunda ise canlı hücre kalmadığını bildirmişlerdir. Oluşan hipoksi sonucunda oksidan-antioksidan dengenin, oksidan lehine bozulması durumunda, oksidatif hasardan söz edilebilir. Oksidatif hasar, superoksitten kaynaklanan serbest radikaller ile nitrik oksitin reaktif türlerinin neden olduğu hasarların bir toplamıdır (139). Serbest radikal reaksiyonları, normal metabolik yolların işleyişlerinin doğal bir sonucudur. Oksidan moleküller tüm yapım ve yıkım reaksiyonları sırasında ve sonrasında sürekli bir oluşum içindedir. Diğer taraftan süperoksit dismutaz, katalaz gibi endojen antioksidanlar; oluşan oksidanların yıkıcı etkilerini ortadan kaldırmak için oksidanlarla devamlı etkileşim halindedir. Fizyolojik koşullarda serbest oksijen radikalleri, organizmanın enfeksiyonlara ve yabancı maddelere karşı savunmasında en önemli moleküllerdir. Ancak serbest radikallerin arttığı ve/veya antioksidanların yetersiz kaldığı durumlarda, serbest radikaller hücrenin yapı elemanları olan protein, lipid, karbonhidrat, nükleik asitler ve enzimlerin yapısını bozarak organizmada oksidatif hasara yol açarlar (140-142). Biz de çalışmamızda histopatolojik ve immünohistokimyasal görünümlerle uyumlu olarak hipoksik süre arttıkça LR 15 ile SF 45 grupları arasında süre ile doğru orantılı olarak SOD değerinin düştüğünü tespit ettik (p<0,05). Yine yaptığımız çalışmada KAT değerinin kontrol grubunda diğer gruplara göre klinik olarak daha yüksek değerlere sahip olduğunu gördük. Oksidoinflamatuar aktivasyonla hücre ve hücre organelerinin membran lipid ve proteinleri okside ve nitroze olacak; DNA yıkımı ve kırılmalarıyla fonksiyon bozuklukları ve hücre ölümleri görülecektir (143). Memeli hücre membranlarının oksidatif yıkımı, lipid peroksidasyonu olarak bilinir. Plazma membranı ve organel lipid peroksidasyonu, serbest radikal kaynaklarının hepsiyle uyarılabilir ve metallerin varlığında artar. Lipid peroksidasyonu çok zararlı bir zincir reaksiyondur. Direkt olarak membran yapısına ve indirekt olarak reaktif aldehitler üreterek diğer hücre bileşenlerine zarar verir. Üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonunda MDA oluşur. MDA, yağ asidi oksidasyonunun spesifik ya da kantitatif indikatörü değildir fakat lipid peroksidasyonunun derecesiyle iyi korelasyon gösterir (144). Bizim safen ven örneklerimizdeki ortalama MDA değeri, histopatolojik görünümle uyumlu olup, hipoksi süresi ile doğru orantılı olarak LR grupları arasında klinik olarak artış göstermiştir (p<0,05). Bu araştırma sonucunda, klasik yöntemle hazırlanan safen ven greftlerinde oluşan endotel hasarınının en aza indirgenmesi için bypass yapılacak zamana kadar geçen sürede en 55 uygun saklama solüsyonunun heparinli LR solüsyonu olduğu ve safen ven implantasyonunun mümkün olduğu kadar çıkarıldıktan ilk 15dk içerisinde yapılması gerektiği ve bu şekilde greftte intimal ve medial koruma sağlayarak, erken dönemde trombüs oluşumunu, geç dönemde ise subendoteliyal fibromüsküler hiperplazi ve ateroskleroz gelişimini azaltarak, erken ve geç dönem greft başarısızlığı oranlarını azaltabileceğini düşünmekteyiz. 56 SONUÇLAR Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dalı'nda, Mayıs Haziran 2011 tarihleri arasında aortokoroner bypass ameliyatı uygulanan, 2 bayan, 8 erkek toplam 10 hasta çalışmaya rızaları alınarak dahil edildiler. Çalışmaya katılan hastaların ortalama yaşı 58,5 (32–77 yaş arası) idi. Uygun saklama solusyonu ve bekleme süresini tespit edebilmek için KABG operasyonu geçiren hastaların safen ven greftlerinin yaklaşık 10cm’lik artık veya yan dal ven örnekleri alınarak TÜTF Histoloji AD. ve İÜCTF Biyokimya AD.‘da histopatolojik ve biyokimyasal parametreler çalışıldı. 1. Histopatolojik olarak Işık mikroskopik incelemede endotel hasarının, kontrol grubuna göre sırası ile 15 LR, 15 SF, 45 LR ve 45 SF gruplarında süre ile ilişkili olarak arttığını tespit ettik. 2. İmmünohistokimyasal olarak endotel hasarı ile doğru orantılı olarak eNOS tutulumunun sırası ile kontrol, 15 LR, 15 SF, 45 LR ve 45 SF gruplarında süre ile ilişkili olarak arttığını tespit ettik. 3. İmmünohistokimyasal olarak endotel hasarı ile doğru orantılı olarak CD 34 pozitivitesinin sırası ile kontrol, 15 LR, 15 SF, 45 LR ve 45 SF gruplarında süre ile ilişkili olarak arttığını tespit ettik. 4. Tunel çalışmasında ven greft saklama solüsyonun da bekleme süresiyle doğru orantılı olarak sırası ile kontrol, 15 LR, 15 SF, 45 LR ve 45 SF gruplarında Tunel pozitif endotel hücresi artışı olduğu gözlendi. 5. Biyokimyasal parametrelerde NO düzeyinin klinik olarak kontrol grubuna göre arttığını, KAT düzeyinin klinik olarak kontrol grubunda daha yüksek olduğunu, SOD 57 düzeyinin gruplar arasında 15dk ve 45dk ile karşlaştırıldığında süre ile orantılı olarak azaldığını ve MDA değerinin klinik olarak süre ile doğru orantılı artış gösterdiğini tespit ettik. Bu araştırma sonucunda, klasik yöntemle hazırlanan safen ven greftlerinde oluşan endotel hasarının en aza indirgenmesi için bypass yapılacak zamana kadar geçen sürede en uygun saklama solüsyonunun heparinli LR solüsyonu olduğu ve safen ven implantasyonunun mümkün olduğu kadar çıkarıldıktan ilk 15dk içerisinde yapılması gerektiği ve bu şekilde greftte intimal ve medial koruma sağlayarak, erken dönemde trombüs oluşumunu, geç dönemde ise subendoteliyal fibromüsküler hiperplazi ve ateroskleroz gelişimini azaltarak erken ve geç dönem greft başarısızlığı oranlarını azaltabileceğini düşünmekteyiz. 58 ÖZET Koroner arter bypass operasyonunun başarısı bypass greftlerinin uzun süre açık kalmalarına bağlıdır. Greft başarısızlığında en büyük neden endotel hasarı gibi görünmektedir. Bu hasar; cerrahi travma, uygun olmayan solüsyonlarda bekletme ve vücut dışında bekleme süresinin uzamasına bağlı olarak ortaya çıkmaktadır. Bu çalışmanın amacı bypass grefti olarak kullanılan safen venin; implantasyona kadar geçen sürede, Serum Fizyolojik ve Laktatlı Ringer solüsyonlarında beklemesinin endotel hasarı üzerine etkilerini araştırmaktır. Mayıs - Haziran 2011 tarihleri arasında 10 hasta çalışmaya alındı. Hastalardan alınan safen ven örnekleri on parçaya bölündü ve beş grup olarak oluşturuldu. Bu gruplar histopatolojik ve biyokimyasal incelenmek üzere hazırlandı. Çalışmadaki; histopatolojik (ışık mikroskopik inceleme), immünohistokimyasal (Nitrik oksid sentaz ve CD34 reaktivitesi) ve tunel çalışmaları, saklama solüsyonlarında bekleme süresiyle doğru orantılı olarak endotel hasarının sırasıyla; kontrol, 15 Laktatlı Ringer, 15 Serum Fizyolojik, 45 Laktatlı Ringer ve 45 Serum Fizyolojik gruplarında arttığını göstermiştir. Biyokimyasal parametrelerde nitrik oksit düzeyinin kontrol grubuna göre arttığını (p<0,05), katalaz düzeyinin kontrol grubunda daha yüksek olduğunu, süperoksid dismütaz düzeyinin gruplar arasında süre ile orantı olarak azaldığını, malondealdehit değerinin klinik olarak artış gösterdiğini tespit ettik. Sonuç olarak, klasik yöntemle hazırlanan safen ven greftlerinde endotel hasarının en aza indirgenmesi için implantasyona kadar geçen sürede en uygun saklama solüsyonunun heparinli LR solüsyonu olduğu ve safen ven implantasyonunun mümkün olduğu kadar ilk 59 15dk içerisinde yapılması gerektiğini, bu şekilde greftte intimal ve medial koruma sağlayarak, erken dönemde trombüs, geç dönemde subendoteliyal fibromüsküler hiperplazi ve ateroskleroz gelişimini azaltarak, erken ve geç dönem greft başarısızlığı oranlarını azaltabileceğini düşünmekteyiz. Anahtar sözcükler: Safen ven, endotel hasarı, laktatlı ringer, serum fizyolojik. 60 THE EFFECTS OF SALINE AND LACTATED RINGER'S SOLUTION USAGE ON ENDOTHELIAL DAMAGE IN PREPARATION OF SAPHENOUS VEIN SUMMARY The success of coronary artery surgery depends on existence of long term graft patency. The most important reason for graft impatency seems to be the endothelial injury. This injury can occur due to surgical trauma, usage of improper solutions for grafts and long time stay away from the body environment. The aim of this study is to reveal endothelial injury levels of saphenous veins as bypass grafts which are sinked into lactated ringer or saline solutions until surgical usage. Ten patients were studied between May-June 2011. The saphenous vein samples were divided to ten parts and studied in five groups. These samples were prepared to be observed histopathologically and biochemically. Histopathological (light microscopic evolutions), immunohistochemical (nitric oxide synthesis, CD34 reactivity )and tunel studies revealed an increase the level of endothelial injury in control, 15 lactated ringer, 15 saline, 45 lactated ringer, 45 saline groups consecutively. Increased levels of nitric oxide in groups compared to control group (p<0,05), higher catalase levels in control group, decrease levels of superoxide dismutase was detected in proportin to time and clinically increased malondealdehite levels were detected in biochemical parameters. 61 As a result, we have the opinion that to decrease endothelial injury of saphenous veins which are prepared by conventional methods, the most proper preservation solution is lactated ringer solution with heparin. Implantation of the saphenous vein graft should be within 15 minutes of harvesting, by this way providing medial and intimal protection of the grafts, early thrombosis and late term subendothelial fibromuscular hyperplasia and atherosclerosis is prevented, so that early and late onset greft failure is prevented. Key word: Saphenous vein, endothelial injury, lactated ringer, saline solution . 62 KAYNAKLAR 1. Duran E, Halıcı Ü. Dünyada kalp-damar cerrahisinin tarihçesi. Duran E (Editör). Kalp ve Damar Cerrahisi’nde. İstanbul: Çapa Tıp Kitabevi; 2004. s.3-13. 2. Sönmez B, Arbatlı H, Demirsoy E, Yağan N, Yılmaz O, Arpaz M ve ark. Koroner arter hastalığının cerrahi tedavisi. Duran E (Editör). Kalp ve Damar Cerrahisi’nde. İstanbul: Çapa Tıp Kitabevi; 2004. s.1343-401. 3. Çobanoğlu A, İşbir S. Koroner arter bypass cerrahisi. Paç M, Akçevin A, Aka SA, Büket S, Sarıoğlu T (Editrler). Kalp ve Damar Cerrahisi’nde. Ankara: MN Medikal & Nobel; 2004. s.657-67. 4. Taggart DP, D’Amico R, Altman DG. Effect of arterial revascularisation on survival: a systematic review of studies comparing bilateral and single internal mammary arteries Lancet, 2001;358:870–5. 5. Favaloro RG. Saphenous vein autograft replacement of severe segmental coronery artery acclusion: operative technique. Ann Thorac Surg, 1968;5(4):334-9. 6. Fitzgibbon GM, Kafka HB, Leach HA, Keon WJ, Hooper GD, Burton JR. Coronary bypass graft fate and patient outcome: angiographic follow-up of 5,065 grafts related to survival in reoperation in 1,388 patients during 25 years. J Am Coll Cardiol, 1996;28:616-26. 7. Fulton GJ, Davies MG, Hagen PO. Preservation of the endothelium ın venous bypass grafts: relevance for graft patency. Asia Pacific Heart J, 1997;6(2):98-106. 8. Tsui JC, Souza DS, Filbey D, Karlsson MG, Dashwood MR. Localization of nitric oxide synthase in saphenousvein grafts harvested with a novel “no-touch” technique: potential role of nitric oxide contribution to improved early graft patency rates. J Vasc Surg, 2002;35(2):356-62. 63 9. Boerboom LE, Bonchek LI, Kissebah AH, Werner PH, Pepper JR, Olinger GN et al. Effect of surgical trauma on tissue lipids in primate vein grafts: relation of plasma lipids. Circulation, 1980;62:142-7. 10. Bonchek LI. Prevention of endothelial damage during preparation of saphenous veins for bypass grafting. J Thorac Cardiovasc Surg, 1980;79(6):911-5. 11. Barber HB, Standeven JW, Reese J. Twelve-year experience with internal mammary artery for coronary artery bypass. J Thorac Cardiovasc Surg, 1985;90(5):668-75. 12. Angelini GD, Williams HM, Morgan R, Newby AC. Distention promotes platelet and leukocyte adhesion and reduces short-term patency in pig arteriovenous bypass grafts. J Thorac Cardiovasc Surg, 1990;99(3):433-9. 13. Motwani JG, Topol EJ. Aortocoronary saphenous vein graft disease pathogenesis, predisposition, and prevention. Circulation, 1998(97): p. 916-31. 14. Anggard E. Nitric oxide: mediator, murderer, and medicine. Lancet 1994;343:1199206. 15. Fadini G P, Kreutzenberg S, Coracina A, Baesso I. Circulating CD341 cells, metabolic syndrome, and cardiovascular risk. European Heart Journal, 2006;27:2247–55. 16. Lyngbaek S, Schneider M, Hansen JL, Sheikh SP. Cardiac regeneration by resident stem and progenitor cells in the adult heart. Basic Res Cardiol, 2007;102:101–14. 17. Urbich C, Dimmeler S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ Res, 2004;95:343–53. 18. Aksoy Y. Antioksidan mekanizmada glutatyonun rolü. T Klin J Med Sci 2002;22:4428. 19. Önder MR, Barutçuoğlu B. Endotel. İstanbul: levent ofset basım, 2007:48-50. 20. Srivatsa SS,Edwards WD, Boos CM. Histologic correlates of angiograpic chronic total coronary artery occlusions. Influence of occlusions duration on neovascular channel patterns and intimal plaque composition. J Am Coll Cardiol, 1997;29:955-63. 21. Walsh K, Smith RC, Kim HS. Vascular Cell Apoptosis in Remodeling Restenosis, and Plaque Rupture . Circ. Res, 2000;87;184-8. 22. S Livesey. Coronary bypass surgery. Medicine, 2006;34:5 23. Beck CS. Coronary artery disease: physiologic consepts; surgical operation. Ann. Surg, 1957;145(4):439-60. 24. Vineberg AM, Shanks J, Pifarr’e R, Criollos R, Kato Y, Baichwal KS. Myocardial revascularization by omental graft without pedicle: experimental backgraund and report on 25 cases followed 6 to 16 months. J Thorac Cardiovasc Surg, 1965;49:10329. 64 25. Vineberg AM. The Vineberg operation. I. Revascularization of the heart. JAMA, 1966;195(8): Suppl:43-7. 26. Vineberg AM. Revascularization of the entire heart by internal mammary artery implantation, epicardiectomy and free omental graft. Can Med Assoc J, 1966;94(8): 378-85. 27. May AM, Bailey CP. Coronary endarterectomy. J İnt Coll Surg, 1958;(Part 1): 160-3. 28. Bailey CP, May A, Lemmon WM. Survival after coronary endarterectomy in man. J Am Med Assoc, 1957;164(6): 641-6. 29. Sabiston DC. Direct surgical management of congenital and acquired lesions of the coronary circulation. Prog Cardiovasc Dis, 1963;24:299-316. 30. Garrett HE, Dennis EW, DeBakey ME. Aortocoronary bypass with saphenous vein graft. Seven-year follow-up. 1973 JAMA, 1996;13;276(18):1517-20. 31. Garrett HE, Dennis EW, DeBakey ME. Aortocoronary bypass with saphenous vein graft. Seven-year follow-up. JAMA, 1973;12;223(7):792-4. 32. Green GE. İnternal mammary artery-to-coronary artery anastomosis. Three-year experience with 165 patients. Ann Thorac Surg, 1972;14(3):260-71. 33. Green GE, Stertzer SH, Reppert EH. Coronary arterial bypass grafts. Ann Thorac Surg, 1968;5(5):443-50. 34. Rosengart TK, Lee LY, Patel SR, Sanborn TA, Parikh M, Bergman GW et al. Angiogenesis gene therapy: phase I assessment of direct intramyocardial administration of an adenovirus vector expressing VEGF 121 c DNA to individuals with clinically significant severe coronary artery disease. Circulation, 1999; 100(5):468-74. 35. Lawrence H, Cohn MD. Fifty years of open-heart surgery. Circulation, 2003;107:216870. 36. Sarıbülbül O. Kalp akciğer makinası–ekstrakorporeal dolaşım. Duran E (Editör). Kalp ve Damar Cerrahisi’nde. Birinci baskı. İstanbul: Çapa Tıp Kitabevi; 2004. s.1047-74. 37. Cosgrove DM, Loop FD, Saunders CL, Lytle BW, Kramer JR. Should coronary arteries with less than fifty percent stenosis be bypassed? J Thorac Cardiovasc Surg, 1981;82:520-30. 38. Thatte HS, Khuri SF. The coronary artery bypass conduit: I. Intraoperative endothelial injury and its implication on graft patency. Ann Thorac Surg, 2001;72:2245-52. 39. Erentürk S. Koroner Bypass Operasyonlarında Greft Seçimi, GKD Derg, 1997;5:145155. 40. Süngün M. Variköz venler ve kronik venöz yetmezlik. Duran E (editor). Kalp ve Damar Cerrahisi’nde. Birinci baskı. İstanbul, Çapa Tıp Kitapevi; 2004. s.879-96. 65 41. Tağıl M. Üst ve alt ekstremite venlerinin anatomisi. Türkiye Klinikleri Journal of Surgery, 2003;8(2):73-80. 42. Tok R. Vazodilatör Solüsyonlarla Mekanik Distansiyon Uygulanan Safen Vende Apoptozisin Yeri (tez). Elazığ: Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi; 2007. 43. Ramelet AA, Monti M. Venous physiology and pathophysiology of the lower limbs. In: Bounameaux H, Buchheim G, Capasso P (eds). Phlebology The Guide. 4th ed. Paris, France: Elsevier SAS; 1999. p.59-75. 44. Lytle BW, Loop FD, Cosgrove DM, Ratliff NB, Easley K, Taylor PC. Long-term (5 to 12 years) serial studies of internal mammary artery and saphenous vein coronary bypass grafts. J Thorac Cardiovasc Surg, 1985;89(2):248-58. 45. Lytle BW, Loop FD, Thurer RL, Groves LK, Taylor PC, Cosgrove DM. Isolated left anterior descending coronary atherosclerosis: long-term comparison of internal mammary artery and venous autografts. Circulation, 1980;61(5):869-74. 46. Liao L, Kong DF. Angiographic changes in vein grafts: stable surrogate or seductive siren? Am Heart J, 2003;145(2):187-9. 47. Stoney WS, Alford WC, Burrus GR, Glassford DM, Petracek MR, Thomas CS. The fate of arm veins used tor aorta-coronary bypass grafts. J Thorac Cardiovasc Surg, 1984;88(4):522-6. 48. Grondin CM, Campeau L, Lesperance J, Solymoss BC, Vouhe P, Castonguay YR et al. Atherosclerotic changes in coronary vein grafts six years after operation. Angiographic aspect in 110 patients. J Thorac Cardiovasc Surg, 1979;77(1):24-31. 49. Larson RM, McCann RL, Hagen PO, Fuchs JC, Mitchener JS. Structural and biochemical alterations in canine venous autografts. J Surg Res, 1978;25(4):380-8. 50. Larson RM, McCann RL, Hagen PO, Dixon SH, Fuchs JC. Effects of experimental hypertension and hypercholesterolemia on the lipid composition of the aorta. Surgery, 1977;82(6):794-800. 51. Malone JM, Kischer CW, Moore WS. Changes in venous endothelial fibrinolytic activity and histology with in vitro venous distention and arterial implantation. Am J Surg, 1981;142(2):178-82. 52. Angelini GD, Breckenridge IM, Williams HM, Newby AC. A surgical preparative technique for coronary bypass grafts on human saphenous vein which preserves medial and endothelial functional integrity. J Thorac Cardiovasc Surg, 1987;94(3):393-8. 53. Angelini GD, Passani SL, Breckenridge IM, Newby AC. Nature and pressure dependence of damage induced by distension of human saphenous vein coronary artery bypass grafts. Cardiovasc Res, 1987;21(12):902-7. 54. Souza DS, Dashwood MR, Tsui JC, Filbey D, Bodin L, Johansson B et al. Improved patency in vein grafts harvested with surroinding tissue: results of a randomized study using three harvesting techniques. Ann Thorac Surg, 2002;73(4):1189-95. 66 55. Tsui JC, Dashwood MR. Recent strategies to reduce vein graft occlusion: aneed to limit the effect of vascular damage. Eur J Vasc Endovasc Surg, 2002;23(3):202-8. 56. Grondin CM. Factors influencing graft patency. Cleve Clin Q Spring, 1978;45(1):1078. 57. Smith SH, Geer JC. Morphology of saphenous vein-coronary artery bypass grafts: Seven to 116 months after surgery. Arch Pathol Lab Med, 1983;107(1):13-8. 58. Atkinson JB, Forman MB, Vaughn WK, Robinowitz M, McAllister HA, Virmani R. Morphologic cahanges in long-term saphenous vein bypass grafts. Chest, 1985;88(3):341-8. 59. Atkinson JB, Forman MB, Perry JM, Virmany R. Correlation of saphenous vein bypass graft angiograms with histologic changes at necropsy. Am J Cardiol, 1985;1;55(8):9525. 60. Bloom W, Fawcett DW. Text book of histology. 10th ed. Philadelphia: W. B. Saunders Company, 1975:396-413. 61. Ross MH, Kaye GI, Pawlina W. Histology: A text and atlas lippincott williams and wilkins. 4th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2003:341-3. 62. Pekbay A. Kardiyovasküler Cerrahide Klasik Yöntemle Hazırlanan Safen Ven Greftlerinin Endotel Hasarından Korunması (tez). Ankara: Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi; 2007. 63. Gloviczki P, Yao J. Handbook of venous disorders. 2nd ed. London: Arnold, 2001:21-2. 64. Perroulaz G. Morphology and structure of the venous wall. In: Ramelet AA, Monti M, Bounameaux H, Buchheim G, Capasso P (Eds). Phlebology The Guide. 4th ed. Paris, France: Elsevier SAS; 1999. P.51-8. 65. Weiss L, Greep RO. Histology. 4th ed. USA: McGraw-Hill Book Company A Blakiston Publication, Chapter 9, 1977:373-420. 66. Sternberg SS. Histology for pathologist. 2nd ed. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, Chapter 33, 1997:763-86. 67. Kumar V, Cotron RS, Robbıns SL (çeviri: U. Çevikbaş). Basic pathology. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi; 2000:281-340. 68. Pompilio G, Rossoni G, Alamanni F, Tartara P, Barajon I, Rumio C et al. Comparison of endothelium-dependent vasoactivity of internal mammary arteries from hypertensive, hypercholesterolemic, and diabetic patients. The Annals of Thoracic Surgery, 2001;72:1290-7. 69. Dudek RW. High-Yield histology. 2nd ed. England: Lippincott Williams & Wilkins, 2000:(19-24)-(68-70). 70. Önalan O, Endotel hücre fizyolojisi. Türk Kardiyoloji Seminerleri, 2004;4(5): p.48499. 67 71. Akgül E, Tokgözoğlu L. Endotel Fonksiyonlarının Değerlendirilmesi. Türk Kardiyoloji Seminerleri, 2004;4(5): p.506-12. 72. Ersanlı M. Ateroskleroz ve Endotel. Türk Kardiyoloji Seminerleri, 2004;4(5): p.522-9. 73. He GW. Arterial grafts for coronary artery bypass grafting: biological characteristics, functional classification, and clinical choice. The Annals of Thoracic Surgery, 1999;67(1):277-84. 74. Roubos N, Rosenfelt FL, Richards SM, Conyers RA, Davis BB. Improved preservation of saphenous vein grafts by the use of glyceryl trinitrateverepamil solution during harvesting. Circulation, 1995;92:31-6. 75. Cook JM, Cook CD, Marlar R, Solis MM, Fink L, Eidt JF. Thrombomodulin activity on human saphenous vein grafts prepared for coronary artery bypass. J Vasc Surg, 1991;14(2):147-51. 76. Allaire E, Clowes AW. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the ıntimal hyperplastic response. Ann Thorac Surg, 1997;63:582-91. 77. Fortunato G, Di Taranto MD. Polymorphisms and the expression of genes encoding enzymes involved in cardiovascular diseases. Clinica Chimica Acta, 2007;381:21-5. 78. Furchott RF, Zawadzki JV. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial somooth muscle by acetylcholine. Nature, 1980;288:373-6. 79. Furchgott RF, Vanhoutte PM. Endothelium-derived relaxing and contractor factors. Faseb J, 1989;3:2007-18. 80. Ignarro LJ. Endothelium-derived nitric oxide: actions and properties. Faseb J, 1989;3:31-6. 81. Palmer RMJ, Ferrige AG, Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biolojical activity of the endothelium-derived relaxing factor. Nature, 1987;327:524-6. 82. Palmer RMJ, Rees DD, Ashton DS, Moncada S. L-arginine is the physiological precursor for the formation of nitric oxide in endothelium dependent relaxation. Biochem. Biophys. Res. Comm, 1988;153:1251-6. 83. Önder MR, Barutçuoğlu B. Endotel. İstanbul: levent ofset basım, 2007:8-15. 84. Türköz Y, Özerol E. Nitrik Oksit'in etkileri ve patolojik rolleri. Journal of Turgut Özal Medical Center, 1997;4(4):453-61. 85. Calver H, Collier J, Vallance P. Nitric oxide and cardiovascular control. Exp Physiol, 1993;78:303-26. 86. Bayar E. Koroner Bypass Cerrahisinde Sık Kullanılan Beta Blokerlerin (Nebivolol ve Metoprolol) Vasküler Nitrik Oksit Düzeyi Üzerine Etkisinin Karşılaştırılması (tez). Gaziantep: Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi; 2007. 68 87. Shuhaiber JH, Evans N, Massad MG, Geha AS. Mechanisms and future directions for prevention of vein graft failure in coronary bypass surgery. Eur J Cardiothorac Surg, 2002;22:387-96. 88. Kown MH, Yamaguchi A, Jahncke CL, Miniati D, Murata S, Grunenfelder J et al. Larginine polymers inhibit the development of vein graft neointimal hyperplasia. J Thorac Cardiovasc Surg, 2001;121:971-80. 89. Lyngbaek S, Schneider M, Hansen JL, Sheikh SP. Cardiac regeneration by resident stem and progenitor cells in the adult heart. Basic Res Cardiol, 2007;102:101-14. 90. Rauscher FM, Goldschmidt-Clermont PJ, Davis BH, Wang T, Gregg D, Ramaswami P et al. Aging, progenitor cell exhaustion and atherosclerosis. Circulation, 2003;108:45763. 91. Hill JM, Zalos G, Halcox JP. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function and cardiovascular risk. N Engl J Med, 2003;348:593. 92. Scheubel RJ, Zorn H, Rolf-Edgar S. Age-dependent depression in circulating endothelial progenitor cells in patients undergoing coronary artery bypass grafting. J Am Col Cardiol, 2003;42:2073–80. 93. Edelberg JM, Tang L, Hattori K, Lyden D, Rafii S. Young adult bone marrow-derived endothelial precursor cells restore agingimpaired cardiac angiogenic function. Circ Res, 2002;90:89-93. 94. Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972;26:239-57. 95. Mene P, Amore A. Apoptosis: potential role in renal diseases. Nephrol Dial Transplant, 1998;13:1936-43. 96. Leist M, Jaattela M. Four deaths and a funeral: from caspases to alternative mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001;2(8):589-98. 97. Van Loo G, Saelens X, Van Gurp M, MacFarlane M, Martin SJ, Vandenabeele P. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell Death Differ, 2002;9(10):1031-42. 98. McCarthy NJ, Bennett MR. The regulation of vascular smooth muscle cell apoptosis. Cardiovascular Research, 2000;45:747-55. 99. O’Brien JE, Ormont ML, Shi Y, Wang D, Zalewski A, Mannion JD. Early injury to media after saphenous vein grafting. Ann Thorac Surg, 1998;65:1273-8. 100. Rodriguez E, Lambert EH, Magno MG, Mannion JD. Contractile smooth muscle cell apoptosis early after saphenous vein grafting. Ann Thorac Surg, 2000;70:1145-52. 101. Karabulut H, Karabulut 0, Arbak S, Şan T, Sokullu O, Korukçu A ve ark. Koroner bypass cerrahisinde kullanılan safen veninin hazırlanmasinda endotel hasarı: Işık ve elektron mikroskopik inceleme Türk Kardiyoloji Dern Arş, 1998,26:416-24. 69 102. Güngör O. Safen Ven Greft Hazırlanmasında Oksidatif Hasarlanma Ve Buna Sistemik Total Antioksidan Kapasitenin Etkisi (tez). Mersin: Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi; 2009. 103. Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, Tomobe Y, Kobayashi M, Mitsui Y et al. Anovel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature, 1988;332:411-5. 104. Blann AD, Landray MJ, Lip GYH. ABC of antithrombotic therapy An overview of antithrombotic therapy. BMJ, 2002;325:762-5. 105. Buege JA. Aust SD. Microsomal lipid peroxidation, Methods Enzymol. 1978; 52;30210. 106. Sun Y, Oberley LW. Suitability of copper chloride as a reaction terminator for superoxide dismutase activity assay. Clin Chim Acta, 1994;226:101-3. 107. Aebi H. Methods of Enzymatic analyisis. 2nd ed. New York and London: Hans Ulrich Bergmeyer Academic Press, 1974. 108. Tsui JCS, Souza DSR, Filbey D, Karlsson MG, Dashwood MR. Localization of nitric oxide synthase in saphenous vein grafts harvested with a novel ‘‘no-touch’’ technique: Potential role of nitric oxide contribution to improved early graft patency rates. J Vasc Surg, 2002;35:356-62. 109. Shuhaiber JH, Evans N, Massad MG, Geha AS. Mechanisms and future directions for prevention of vein graft failure in coronary bypass surgery. Eur J Cardiothorac Surg, 2002;22:387-96. 110. He G, Rosenfeldt FL, Angus JA. Pharmacological relaxation of the saphenous vein during harvesting for coronary artery bypass grafting. Ann Thorac Surg, 1993;55:12107. 111. Souza DSR, Christofferson RHB, Bomfim V, Filbey D. “No-touch” Technique using Saphenous Vein Harvested with its Surrounding Tissue for Coronary Artery Bypass Grafting Maintains an Intact Endothelium. Scand Cardiovasc J, 1999;(33):323-9. 112. Souza DS, Bomfim V, Skoglund H, Dashwood MR, Borowiec JW, Bodin L et.al. High early patency of saphenous vein graft for coronary artery bypass harvested with surrounding tissue. Ann Thorac Surg, 2001;71:797-800. 113. Hinokiyama K, Valen G, Tokuno S, Vedin JB, Vaage J. Vein graft harvesting induces inflammation and impairs vessel reactivity. Ann Thorac, 2006;82(4):1458-64. 114. Roubos N, Rosenfeldt FL, Richards SM, Conyers RA, Davis BB. Improved preservation of saphenous vein grafts by the use of glyceryl trinitrate-verapamil solution during harvesting. Circulation, 1995;92(Suppl 9):31-6. 115. Cambria RP, Megerman J, Abbott WM. Endothelial preservation in reversed and in situ autogeneous vein grafts: a quantitative experimental study. Ann Surg, 1985;202:50-5. 70 116. Gundry SR, Jones M, Ishihara T, Ferrans VJ. Optimal preparation techniques for human saphenous vein grafts. Surgery, 1980;88(6):785-94. 117. Barner HB. Endothelial preservation in human saphenous veins harvested for coronary grafting. J Thorac Cardiovasc Surg, 1990;100:148-50. 118. Lawrie GM, Weilbacher DE, Henry PD. Endothelium dependent relaxation in human saphenous vein grafts. Effects of preparation and clinicopathologic correlations. J Thorac Cardiovasc Surg, 1990;100:612-20. 119. Hoover EL, Ross M, Fani K, Webb H, Kirshy D, DiMaio F et al. Biochemical and histopathologic comparison between blood and saline storage of canine veins. J Vasc Surg, 1988;7:543-8. 120. Catinella FP, Cunningham JN, Srungaram RK, Baumann FG, Nathan IM, Glassman EA et al. The factors influencing early patency of coronary artery bypass vein grafts. J Thorac Cardiovasc Surg, 1982;83:686-700. 121. Rosenfeldt FL, He GW, Buxton BF, Angus JA. Pharmacology of coronary arter bypass grafts. Ann Thorac Surg, 1999;67:878-88. 122. Haudenschild CC, Gould KE, Quist WC, LiGerfo FW. Protection of endothelium in vessel segments excised for grafting. Circulation, 1981;64 (Suppl2):101-7. 123. Solberg S, Larsen T, Jorgensen L, Sorlie D. Cold-induced endothelial cell detachment in human saphenous vein grafts. J Thorac Cardiovasc Surg, 1987;28:571-5. 124. Kosugi I, Urayama H, Kasashima F, Ohtake H, Watanabe Y. Matrix metalloproreinase9 and urokinase-type plasminogen activator in varicose veins. Ann Vasc Surg, 2003;17:234-8. 125. O’Donnell TF, Iafrati MD. Varicose veins. In: Haimovici H, Ascer E, Hollier LH, Strandness DE, Towne JB (Eds). Haimovici’s Vascular Surgery Principles and Techniques. 4th Ed. Cambridge Massachusets, USA: Blackwell Science Inc; 1996. p.1187-98. 126. Thulesius O, Said S, Shuhaiber H, Neglen P, Gjores JE. Endothelial mediated enhancement of noradrenaline induced vasoconstriction in normal and varicose veins. Clin Physiol, 1991;11:153-9. 127. Ascher E, Jacob T, Hingorani A, Tsemekhin B, Gunduz Y. Expression of molecular mediators of apoptosis and their role in the pathogenesis of lower extremity varicose veins. J Vasc Surg, 2001;33:1080-6. 128. Wang AY, Bobryshev YV, Cherian SM, Liang H, Tran D, Inder SJ et al. Expression of apoptosis-related proteins and structural features of cell death in explanted aortocoronary saphenous vein bypass grafts. Cardiovasc Surg, 2001;9(4):319-28. 129. Jarzembowski T, Navarro A, Zhang W. Effect of preservation media on cellular apoptozis in autologous saphenous vein grefts procured for coronary revascularization. Journal of Surgial Research, 114;2-255. 71 130. Gao YJ, Stead S, Lee RM. Papaverine induces apoptosis in vascular endothelial and smooth muscle cells. Life sci, 2002;70(22):2675-85. 131. Furchgott RF. Endothelium-derived relaxing factor: discovery, early studies and identification as nitric oxide. Biosc Rep, 1999;19:235-51. 132. Ignarro LJ, Cirino G, Casini A, Napoli C. Nitric oxide as a signaling molecule in the vascular system: an overview. J. Cardiovasc. Pharmacol, 1999;34:876-84. 133. Napoli C, Lerman LO. Involvement of oxidation-sensitive mechanisms in the cardiovascular effects of hypercholesterolemia. Mayo Clin. Proc, 2001;76:619-31. 134. De Nigris F, Lerman A, Ignarro LJ, Williams-Ignarro S, Sica V, Baker AH et al. Oxidation-sensitive mechanisms, vascular apoptosis and atherosclerosis. Trends. Mol. Med, 2003;9:351-9. 135. Lev EI, Kleiman NS, Birnbaum Y, Harris D, Korbling M, Estrov Z. Circulating endothelial progenitor cells and coronary collaterals in pat ients with non-ST segment elevation myocardial ınfarction. Journal of Vascular Research, 2005; 42:408-14. 136. Perera D, Kanaganayagam G, Marber M. Stem cells in unstable angina: the dynamic duo. Eur Heart J, 2004;25:999-1000. 137. Adams V, Lenk K, Linke A, Lenz D, Erbs S, Sandri M et al. Increase of circulating endothelial progenitor cells in patients with coronary artery disease after exerciseinduced ischemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004;24:684-90. 138. Thatte HS, Khuri SF. The coronary artery bypass conduit: I. Intraoperative endothelial injury and its implication on graft patency. Ann Thorac Surg, 2001;72(6):2245-52. 139. Aksoy Y. Antioksidan Mekanizmada Glutatyonun Rolü. T Klin J Med Sci, 2002;22:442-8. 140. Halliwell B. Free radicals and antioxidant: a personal view. Nutr. Rev, 1994;52:253-65. 141. Peskin AV. Interactions of reactive oxygen species as cellular Messenger. C Chem. Biol, 1995;2(7):437-45. 142. Hogg N. Free radicals in Disease. Sem Rep. Endocrine, 1998;16(4):241-8. 143. Harlan JM. Neutrophil-mediated 1987;715(Suppl):123-9. vascular injury. Acta Med Scand, 144. Akkuş İ. Serbest radikaller ve fizyopatolojik etkileri. Konya: Mimoza Yayınları, 1995. s.1-47. 72 EKLER 73 Ek 1 74 Ek 2 GÖNÜLLÜNÜN ÇALIŞMAYA KATILMA OLUR FORMU Yukarıda açıkça tanımlanan çalışmanın ne amaçla, kimler tarafından ve nasıl gerçekleştirileceği anlayabileceğim bir ifade ile bana anlatıldı. Bu araştırmadan elde edilen bilgilerin bana ve başka insanlara sağlayacağı yararlar bana anlatıldı. Araştırma sırasında meydana gelebilecek riskler ve rahatsızlıklar bana anlayabileceğim bir dille anlatıldı. Araştırma sırasında oluşabilecek zarar durumunda gerçekleştirilecek işlemler bana anlatıldı. Araştırmanın yürütülmesi sırasında olası yan etkiler, riskler ve zararlar ve haklarım konusunda 24 saat bilgi alabileceğim bir yetkilinin adı ve telefonu bana verildi. Araştırma kapsamındaki bütün muayene, tetkik ve testler ile tıbbi bakım hizmetleri için benden ya da bağlı bulunduğum sosyal güvenlik kuruluşundan hiçbir ücret istenmeyeceği bana anlatıldı. Araştırmaya hiçbir baskı ve zorlama altında olmaksızın gönüllü olarak katılıyorum. Araştırmaya katılmayı reddetme hakkına sahip olduğum bana bildirildi. Sorumlu araştırmacı / hekime haber vermek kaydıyla, hiçbir gerekçe göstermeksizin istediğim anda bu çalışmadan çekilebileceğimin bilincindeyim. Bu çalışmaya katılmayı reddetmem ya da sonradan çekilmem halinde hiçbir sorumluluk altına girmediğimi ve bu durumun şimdi ya da gelecekte gereksinim duyduğum tıbbi bakımı hiçbir biçimde etkilemeyeceğini biliyorum. Çalışmanın yürütücüsü olan araştırmacı / hekim ya da destekleyen kuruluş, çalışma programının gereklerini yerine getirmedeki ihmalim nedeniyle, benim onayımı almadan beni çalışma kapsamından çıkarabilir. Çalışmanın sonuçları bilimsel toplantılar ya da yayınlarda sunulabilir. Ancak, bu tür durumlarda kimliğim kesin olarak gizli tutulacaktır. Yukarıda yer alan ve araştırmadan önce gönüllüye verilmesi gereken bilgileri gösteren Gönüllü Bilgilendirme Formu adlı metni kendi anadilimde okudum. Bu bilgilerin içeriği ve anlamı, yazılı ve sözlü olarak açıklandı. Aklıma gelen bütün soruları sorma olanağı tanındı ve sorularıma doyurucu cevaplar aldım. Bu koşullarla, söz konusu araştırmaya hiçbir baskı ve zorlama olmaksızın gönüllü olarak katılmayı kabul ediyorum. Bu formun tamamının imzalı bir kopyası bana verildi. Gönüllünün; (bu bölüm gönüllünün kendi el yazısı ile doldurulacaktır) Adı- Soyadı: İmzası: Adresi (varsa telefon ve/veya fax numarası): ............................................................................................. Tarih: Velayet ya da vesayet altında bulunanlar için; (bu bölüm veli/vasinin kendi el yazısı ile doldurulacaktır) Veli ya da Vasinin Adı- Soyadı: İmzası: Adresi (varsa telefon ve/veya fax numarası): ........................................................................................... Tarih: Gerekli durumlar için; (bu bölüm görüşme tanığının kendi el yazısı ile doldurulacaktır) Görüşme Tanığının Adı- Soyadı: İmzası: Adresi (varsa telefon ve/veya fax numarası): ........................................................................................... Tarih: Açıklamaları Yapan Araştırmacının (bu bölüm araştırmacının kendi el yazısı ile doldurulacaktır) Adı- Soyadı, Ünvanı: İmzası: Tarih: 75