Anormal Hemoglobinler - Talasemi Federasyonu
Transkript
Anormal Hemoglobinler - Talasemi Federasyonu
5. Uluslararası Talasemi Yazokulu 5th International Thalassemia Summerschool ANORMAL HEMOGLOBNLER Doç. Dr. Canan Vergin Dr.Behçet Uz Çocuk Hastalıkları Eitim Aratırma Hastanesi, ZMR e-mail: cvergin@gmail.com Normal hemoglobin zincirlerindeki amino asitlerdeki yer deiiklii, çesitli füzyon ve mutasyonlarla ortaya çıkan anormal hemoglobinler Türkiye'de -talasemi'den sonra en sık görülen hemoglobinopatilerdir. Normal erikin bir insanda hemoglobinin %95-97'sini meydana getiren HbA molekülü, yapısında iki alfa () ve iki de beta () globin zinciri (22) zincirinden meydana gelen tetramer yapıda bir metaloproteindir. Fetal hayat ve yenidoanın major hemoglobini olan HbF (22)ise iki alfa ve iki gama () zincirinden meydana gelmekte olup normal erikin insanda düzeyi %1'in altındadır. Yapısında iki alfa ve iki delta () zinciri bulunan HbA2 (22) normal erikinde %2-3 oranında bulunur. Embriyonik hayatın erken dönemlerinde sentezlenen Hb Gower [Hb Gower I (22) ve Gower II (22)] ve Hb Portland'ın [Portland I (22) ve Portland II (22)] yapısında yer alan alfa benzer zinciri zeta (), beta benzer zincirleri ise epsilon () ve gama () dır. nsan hemoglobinlerinin yapısı, fetus ve erikindeki miktarı tablo 1'de verilmitir. Tablo 1: Normal insan hemoglobinleri (* Total hemoglobinin %'si ) Hb cinsi Yapısı Erikindeki miktarı Fetusta bulunan miktar ve yapım zamanı lk üç ayda 22 Hb Gower 1 lk üç ayda 22 Hb Gower 2 lk üç aydan sonra ve kordon 22 Hb Portland kanında 1 lk üç aydan sonra 22 HbH ve talasemi Hb Portland taıyıcılarında az 2 miktarda ntrauterin 10-12.haftada 22 Üçüncü trimestirde 22 %1-2* 6-8. haftada yapımı balar 22 % 2-3* Hb F % 95* Hb A2 Hb A Hemoglobin sentezindeki kalıtsal anormallikler bir ya da daha fazla Hb polipeptid zincirlerinin azalmı sentezine veya yapısal olarak anormal Hb varyantlarına balı 47 DOÇ. DR. CANAN VERGN geliir. Hemoglobinin yapısında bulunan globin zincirlerinin yapılarındaki aminoasit deiiklii ile anormal hemoglobinler veya Hb varyantları olumaktadır. Bu deiim pek çounun fonksiyonunu deitirmedii gibi klinik bir semptom da göstermemektedir. Bazı anormal hemoglobinler ise yapısal özelliklerine balı olarak polimerleme (HbS), kristalleme (HbC) veya dayanıksız olmaları nedeniyle hemolitik anemiye neden olurlar. Oksijen afinitesinde artı gösteren anormal hemoglobinler eritropoezi arttırırken, afinitede azalmaya neden olanlar ise siyanoz ile kendini gösterir. Bazı hemoglobin varyantları da talasemik fenotip göstermektedirler. Anormal hemoglobinler fonksiyonel karakterlerine ya da yapısal anormalliklerine göre sınıflandırılabilirler (Tablo 2). Yapısal özelliklerine göre bir veya iki aminoasit deiimi, aminoasit eklenmesi veya çıkarılması ya da iki farklı polipeptidin birlemesiyle meydana gelen hibrid zincirler (füzyon Hb) eklindedir. Günümüzde total anormal Hb varyant sayısının 909'a ulatıı belirtilmitir. Çeitli Hb moleküllerinin yapısında yer alan zincirler ve bunlar üzerinde meydana gelen deiiklikler aaıda gösterilmitir (Tablo 3). Tablo 2. Anormal hemoglobinlerin sınıflandırılması A) Anormal hemoglobinlerin moleküler baza dayalı sınıflandırılması 1. Bir amino asitin yer deitirmesi En sık görülenler: HbS, HbC, Hb D Los Angeles, Hb O Arab 2. Aminoasit delesyonu (Hb Freiburg) 3. Füzyon hemoglobinler (Hb Lepore) 4. Uzamı subünite (Hb Constant Spring) B) Klinik önemlerine göre sınıflandırma 1. Orak Hücre Sendromu a) Orak hücre taıyıcıları b) Orak hücre hastalıı (Hb S-S; Hb S-C; Hb S-D Los Angeles; Hb S-O Arab) 2. Unstable Hemoglobinler 3. Anormal oksijen afinitesi gösteren hemoglobinler a) Yüksek afinite: Ailesel eritrositoz b) Düsük afinite: ailesel siyanoz 4. M hemoglobinler 5. Talasemik fenotip gösteren yapısal varyantlar Hb Lepore Hb E 48 ANORMAL HEMOGLOBNLER Tablo 3: Anormal hemoglobinlerin yapısında yer alan , , ve globin varyantları Bozukluk Toplam zinciri zinciri zinciri zinciri _________________________________________________________________________ Bir a.a.deiimi ki a.a. deiimi Delesyon (çıkarma) nsertion (eklenme) Delesyon/insertion Uzamı zincir Füzyon (birleme) Toplam 759 29 21 7 11 18 18 863 253 1 9 5 0 9 0 277 405 23 12 2 11 9 9 471 34 0 0 0 0 0 8 42 67 5 0 0 0 0 1 73 Bunlardan 277 tanesi alfa, 471 beta, 73 gama, 42 delta, 29 iki amino asit deiimi aynı zincirde, 18 füzyon, 18 uzamı zincir ve 39 tanesinde delesyon, insertion veya delesyon/insertionun birlikte bulunduu gösterilmitir. Alfa, beta, gamma veya delta zincirlerindeki amino asitlerde yer deiiklii, çesitli füzyon ve mutasyonlar sonucu ortaya anormal hemoglobinlerin dünyadaki daılımı corafi bölgelere ve etnik gruplara göre deimektedir. Milyonlarca insanın etkilendii anormal hemoglobinlerden en yaygın olanları S, C, D-Punjap ve E'dir. Sık görülen HbS'nin Afrika kıtasındaki bazı yörelerde daılımı %40-50 civarındadır. Anormal hemoglobin varyantlarından 33 tanesi ülkemizde gözlenmi olup bunlardan 7 tanesi ilk olarak Türklerde gösterilmitir. Ülkemizde belirlenen anormal hemoglobinlerden en önemlisi Hb S olup, daha az oranda Hb D Los Angeles (121) ve Hb O Arab (-121) görülmektedir. HbC ise birkaç vakada gösterilmi, dier anormal hemoglobinler ise çok az sayıda olguda tanımlanmıtır (Tablo 4). Bunlarin dıında Hb J Ankara (-10 (A7) Ala-Asp); Hb Ube II (-68 Asn-Asp) ve Hb J Iran (-77 (EF1) His-Asp) gibi varyantlar; ilk kez Türkiye'de saptanmı anormal hemoglobinlerden Hb Ankara, Hb Antakya, Hb Bakent, Hb stanbul, Hb Çapa, Hb Adana, Hb Hakkari; yurtdıında çalıan Türk isçilerinde ilk kez bulunan anormal hemoglobinlerden Hb J Anatolia, Hb Moabit bulunmutur. 49 DOÇ. DR. CANAN VERGN Tablo 4. Türkiye’de belirlenen anormal hemoglobinler Hb Adı Hb Adana* Hb Ankara* Hb J Antakya* Hb Beograd Hb Brockton Hb C HbD-Los Angeles Mutasyon 2-59 GlyAsp -10 AlaAsp -65 LysMet -121 GluVal -138 AlaPro -6 GluLys -121 GluGln Hb E -26 GluLys Hb E Saskaton Hb F-Bakent* Hb G-Coushatta Hb Hakkari* Hb Hamadan Hb City of Hope Hb stanbul* Hb J-ran Hb Knossos Hb Köln HbLepore-Boston Hb M-wate Hb Moabit Hb N-Baltimore Hb O-Arab -22 GluLys 128 AlaThr -22 GluAla -31 LeuArg -56 GlyArg -69 GlySer -92 HisGln -77 HisAsp -27 AlaSer -95 ValMet Fusion Hb -87 HisTry -86 LeuArg -95 LysGlu -121 GluLys Hb O-Padova Hb Q-ran Hb P-Nilotic Hb Ube-2 Hb Summer Hill Hb J-Anatolia Hb Strumia Hb Çapa* Hb J-Meerut Hb J-Paris I -30 GluLys -75 AspHis - (-)2 -68 AsnAsp -52 AspHis -61 LysThr -112 HisArg -94 AspGly -120 AlaGlu -12 AlaAsp Bulunduu yöre Adana Kastamonu Antakya Göçmen stanbul zmir, Adana Birden fazla bölgede Birden fazla bölgede Kayseri Ankara Kastamonu, Denizli Hakkari Batı Trakya Yazarlar Çürük ve ark. Arcasoy ve ark. Huisman ve ark. Arcasoy ve ark. Ulukutlu ve ark. Göksel/Kılınç/Özsoylu Dinçer/Çavdar/Özsoyl u Aksoy/Arcasoy/Altay Prozorova/Gürgey Altay ve ark. Dinçol/Sözmen Gürgey ve ark. Dinçol ve ark Kutlar ve ark. Göçmen Aksoy ve ark. Ankara Arcasoy ve ark. Kutlar ve ark. Malaya Gürgey ve ark. Diyarbakır,K. Kıbrıs Çavdar ve ark. Bursa Özsoylu ve ark. Denizli Knuth ve ark. Antalya Bircan ve ark. Kütahya,Kıbrıs,Trak Altay/Cin/Aksoy ya Adana Kılınç ve ark. Adana, Batı Trakya Aksoy ve ark Orta Anadolu Altay ve ark. Kayseri Bilgin ve ark. Kuzey Kıbrıs Cin ve ark. Giardano ve ark. Bursa Akar ve ark. Kars Dinçol ve ark. Yalçın ve ark. Çukurova Dikmen ve ark. Hb S (6 GluVal) dünyada en sık görülen ve ilk belirlenen anormal Hb varyantı olup, klinik açıdan çok önemlidir. Karakteristik bir corafi daılım gösteren varyant 50 ANORMAL HEMOGLOBNLER en sık Afrika’da ve bu kıtadan göç eden siyahların yaadıı ülkelerde, daha az sıklıkla Akdeniz Ülkeleri, Suudi Arabistan ve Hindistan’ın bazı bölgelerinde gözlenir. Ülkemizin güneyinde yer alan Çukurova bölgesinde (Antakya, Adana ve çel) OHA taıyıcılık prevalansı %25 olarak tespit edilmi olup, taıyıcılık oranı bazı köy ve kasabalarda %44’e kadar ulamaktadır. Orak hücre anemisi ve taıyıcıları elektroforez ile belirlendikten sonra taıyıcıların evlenmesi durumunda gebeliin 10-12. haftasında DNA analizi ile prenatal tanı yapılarak hasta çocukların doması önlenmektedir. Bu hastalık resesif olarak kalıtılan, 11. kromozomun kısa kolu üzerinde yer alan globin gen mutasyonları sonucu olumaktadır. Orak hücre anemisine neden olan Hb S molekülü -globin zincirindeki bir aminoasit deiimiyle ortaya çıkmakta ve -globin geninin 6. pozisyonundaki AT dönüümü ile glutamik asit yerine valin (GAGGTG) geçmektedir. Bu aminoasit deiiklii ile oluan HbS’in deoksijenize durumda çözünürlüü azalarak eritrositler içinde çökelmesi sonucu oraklama meydana gelmektedir. Bu mutasyonun homozigot olduu bireylerde orak hücre hastalıı (HbSS) görülmekte, bulgular yaamın altıncı ayından sonra ortaya çıkmaktadır. Bu hastalıı taıyanlar asemptomatik olup AT mutasyonu için heterozigot (HbAS) olarak bilinmektedir. Taıyıcılar Hb elektroforezi ile kolayca tehis edilebilir. Orak hücre taıyıcılıında HbA ve HbS birlikte bulunur. Ancak HbA oranı her zaman HbS’ den fazladır. Taıyıcılarda klinik veya hemotolojik herhangi bir bulgu yoktur. Ancak ciddi hipoksi olusturan kosullarda, vazooklusiv komplikasyonlar ortaya çikabilir. Hastalarda orta derecede normositik, normokromik anemi vardır. Hb konsantrasyonu genellikle 5-9 g/dl (ortalama 7.5g/dl) arasındadır. Periferik yaymada tipik olarak hedef hücreler, poikilositoz, orak hücreler, ovalositler, çekirdekli eritrositler ve Howell-Jolly cisimcikleri görülür. Retikülosit sayısı %5-15 arasindadir. Klinik olarak, ciddi hemolitik hastalık tablosu ile seyreder. Bu klinik tablo, eritrositlerin deformabilite özelliinin kaybolmasi ve yıkılması yanı sıra; oraklaan eritrositlerin oluturduu tıkanıklıklar sonucu olusan iskemik deiikliklerle karakterizedir. HbE (26: GluLys), dünyada ikinci sıklıkla görülen Hb varyantıdır. Yeryüzünde yaklaık 1 milyon homozigot ve 30 milyon heterezigot olgu bulunmakta ve bu olguların %80’ni Güneydou Asya’da yaamaktadır. Tayland’ın bazı yörelerinde bu oran %45’lere kadar çıkmaktadır. HbE hafif -talasemi gibi ya da kronik transfüzyona baımlı homozigot talasemiden ayırdedilemeyen deiken bir klinik seyir gösterebilir. Birçok olguda aır anemi, büyüme gerilii, bacak ülserleri, kemik deformitesi, enfeksiyona yatkınlık, demir yükü ve hipersplenizm görülür. Dier Hb varyantlarından farklı olarak eritrositlerde mikrositoz ve hipokromi gözlenir. Elektroforezde (pH 8.6) mobilitesi HbC’ye çok benzer olup kesin ayırım asit pH’da agar jel elektroforezi, HPLC ve mutasyon analizleri ile yapılmaktadır. Heterozigot olgular sessizdir. Klinik olarak, hafif anemi olsun ya da olmasın mikrositoz (MCV: 65 fl), ayrıca hafif eritrositoz gözlenir. Taıyıcılarda Hb 51 DOÇ. DR. CANAN VERGN elektroforezinde %30-45 HbE bulunur. Homozigot olgularda ise belirgin mikrositoz (MCV: 55-65 fl) ve morfolojik deiimler (hedef hücreler, leptositoz) görülür. Anemi hafif seyreder. HbC (6: GluLys), dünyada üçüncü sıklıkla gözlenen Hb varyantı olup, zincirinin altıncı pozisyonunda glutamik asit yerine lizin geçmitir. Batı Afrika kıyılarında taıyıcılık oranı %25, Amerika Birleik Devletleri'ndeki siyah ırkta görülme oranı %3’tür. Heterozigotlarda klinik bulgu görülmez, Hb konsantrasyonu normal, eritrosit kitlesi ve yaam süresi azalmı, retikülosit normaldir. Periferik yaymada %5-30 kadar hedef hücre, elektroforezde %30-40 HbC, %50-60 HbA saptanır. Hastalarda hafif hemoliz bulguları ve splenomegali vardır. Dolaımda normalden daha rijid olan HbC içeren eritrositlerin parçalanması ile mikrosferosit oluumu ve eritrositlerde HbC kristalleri görülür. Hastaların eritrositlerinin oksijene afinitesi düük bulunmutur. Hb düzeyleri 8-12 g/dl arasında olup, periferik yaymada hedef hücreleri ve özellikle eritrositlerin gece boyunca %3 sodyum kloridle inkübasyonu sonrasında eritrosit içinde HbC kristalleri görülür. Osmotik frajilite azalmıtır. HbC, elektroforetik tekniklerde (alkalen pH’da) HbA2 , HbE ve HbO Arab ile aynı mobiliteye sahip olması nedeniyle ayrılamaz. Tam olarak ayırım kolon kromatografisi ve HPLC ile yapılır. HbD (121 GluLys): HbD- Los Angeles ve HbD- Punjap olarak da adlandırılır. Hindistan da Punjap Sih’lerinde %2-3 oranında görülürken ran, Amerikalı siyahlar ve beyaz ırkta da nadiren gözlenir. Ülkemizde Hb D nadir deildir. Tamamen asemptomatik heterozigot ekli de tanımlanmıtır. Türkiye’de yapılan çalımalarda bu oran %0.2 olarak bulunmutur. pH 8.6’da elektroforetik mobilitesi HbS ile aynı olarak bulunmutur. HbS’ den ayırımı oraklama testi, asit pH’da yapılan agar jel elektroforezi, HPLC ve mutasyon analizleri ile yapılır. Taıyıcılarda klinik, hematolojik yada fizyolojik herhangi bir anomali gözlenmezken, homozigot olgularda orta derecede hemolitik anemi ve splenomegali vardır. Periferik yaymada hafif mikrositoz, poikilositoz, minimal hemoliz bulguları görülür. HbF ve HbA2 düzeyleri normaldir. Hb D Los Angeles (-121 Glu-Gln) ilk kez Penjap’da ngiliz ve Hintli karıımı bir ailede kesfedilmi, kimyasal yapısı 1972'de gösterilmitir. Pakistan, Kuzey Batı Hindistan, Penjap ve Çin’in belirli bölgelerinde yüksek sıklıkta olmak üzere dünyanın pek çok bölgesinde görülmektedir. Hb O: -globin zincirinin 121. kodonunda glutamik asit yerine lizin gelmesi ile oluan Hb O Arab, Amerikan zencileri, Araplar, Sudanlılar, Bulgarlar gibi farklı etnik gruplarda ve Türk halkı ile Kıbrıs Türklerinde bildirilmitir. ANORMAL HEMOGLOBNLERN AYIRIMI Anormal hemoglobinleri, dierlerinden ayırd edebilmek amacıyla tam kan sayımı ve deiik Hb elektroforez yöntemleri kullanılmakta ve kesin ayırım yüksek performans likid kromatografi teknii (HPLC) ile yapılmaktadır. Kolon kromatografisi ile aynı prensipe dayanan reverse faz HPLC ile globin zincir ayırımı 52 ANORMAL HEMOGLOBNLER mümkün olmaktadır. Hemoglobinopati programında katyon deitirici HPLC kullanılır. Hemoglobinopati programında Hb F, Ao, A2/E, D, S ve C’ler için belirlenen pencereler ile retansiyon zamanı kullanır. Retansiyon markerında 7 hemoglobin yer alır: A, F, S, C, D, E ve A2. Her örnek analizinden sonra kromatogram kopyası otomatik olarak yazdırılır. Unstable hemoglobin varyantları elektroforezde az veya hiç görülmeyebilir. Bu varyantlar DNA analizi ile belirlenir. Hangi globin geni üzerinde mutasyonun bulunabilecei tahmin edilerek PCR temeline dayalı DNA yöntemleri ile moleküler defekt belirlenir. Hemoglobin Elektroforezi Elektroforez, genel olarak, bir çözelti içerisindeki elektrik yüklü partiküllerin elektriksel alanda göç ettirilerek ayrıtırılması prensibine dayanan bir analiz yöntemidir. Yüklü moleküller, çözelti içerisinde ortamın pH'sına balı olarak deimek üzere (+) veya (-) elektrik yüklü birer partikül olarak davranırlar. Elektriksel alanda (+) yüklü partiküller katota (negatif yüklü elektrot), (-) yüklü olanlar ise anoda (pozitif yüklü elektrot) doru göç ederler. Ayrıtırılmak istenen örnein uygulandıı ve üzerinde veya içerisinde göç ettii ortam olarak kaıt, nisata, agar, poliakrilamit jelleri ve sellüloz asetat membranı kullanılır. Niasta jelinin uygun hazırlanıı dierlerine göre daha zor olması nedeniyle günümüzde yaygın deildir. Agaroz jel elektroforezi destekleyici ortam olarak bileenleri agaroz ve agaropektin olan agarın kullanıldıı kullanılı bir yöntemdir. Sellüloz asetat elektroforezinin avantajı ayrıtırma hızının yüksek oluu ve effaflatırılan membranların uzun süre saklanabilmesidir. Poliakrilamid jel elektroforezinde elektroforetik ayırımı salayan balıca faktör bileiklerin büyüklüü olup, elektrik yüklerinin önemi daha azdır. Büyük bileikler göç sırasında küçük olanlara göre daha fazla polimerde tutulurlar ve daha yava göç ederler. Normal yetikin bir kiide sellüloz asetat üzerinde ( pH 8.6; 9.1) yapılan elektroforezde %98 oranında Hb A gözlenir. Hb F %1’in altında olduu için görülmez. Aplikasyon noktasına yakın bölgede eritrosit membran artıkları ve karbonik anhidraz eser halde izlenebilir. Bu kısımda göç eden Hb A2 eser miktarda bulunur. Kordon kanı ve yenidoan örneklerinde ise Hb A’nın hemen yanında (katodik tarafta) Hb F gözlenir. -talasemi taıyıcılarda Hb A2 miktarı artmı olup bazı vakalarda Hb F miktarında görülür. Orak hücre anemisi taıyıcılarda Hb A yanısıra Hb A2 ile Hb F arasında göç eden Hb S bandı görülür. Hastalarda ise Hb A gözlenmez, bantların büyük kısmı Hb S olup deiik oranda Hb F bulunmaktadır. Alfa talasemi olgularında kordon kanı incelenmesinde Hb A’dan daha hızlı göç eden (daha anodik) Hb Bart’s izlenir. Bu Hemoglobin 4 globin zincirinden olumutur. Yetikin hastalarda ise 4 globin zincirden oluan Hb H izlenebilir. Bu hemoglobinde (HbH) A’dan daha hızlı olup elektroforezde HbA’nın önünde görülür. Kolayca denatüre olduu için elektroforezde az miktarda veya bekletilmi kan örneklerinde hiç görülmeyebilir. 53 DOÇ. DR. CANAN VERGN Hb C ve Hb E selüloz asetat elektroforezde Hb A2 ile aynı yerde göç ederler. Hb S, Hb D, Hb G aynı yerde bant verirler. Hb S ile dierlerinin ayrımı oraklama testi ile yapılabilir. Alkali pH’da hemoglobin molekülü negatif yüklüdür ve elektriksel ortamda anoda doru göç eder. Yüzey yük deiiklii olan yapısal varyantlar ise farklı göç ederler. Alkali ortamda selüloz asetat kaıdı üzerine uygulanan hemolizat elektriksel güç uygulanarak basit ve seri bir ekilde hemoglobin tiplendirilmesi yapılır ve anormal hemoglobinler tiplendirilebilir. Elektroforez veya dier yöntemlerde farklılık olmakla beraber yöntem hatası olarak düünülen ve kefedilmeyi bekleyen yeni anormal Hb moleküllerinin olabilecei unutulmamalıdır. KAYNAKLAR 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Benz EJ: Hemoglobin variants associated with hemolytic anemia, altered oxygen affinity, and methemoglobinemias. Hematology Basic Principles and Practice. 4th edition. 2005, 645-652 Beutler E: The sickle cell diseases and related disorders. Williams Hematology. 6th edition 2001, 581-597 Lukens JN: Unstable hemoglobin disease. Wintrobe’s Clinical Hematology. 2th edition 2004, 1313-1318 Lukens JN: Abnormal hemoglobins: general principles. Wintrobe’s Clinical Hematology. 2th edition 2004, 1247-1262 Katsanis E., Luke KH., Hsu E, Yates JR: Hemoglobin E: a common hemoglobinopathy among children of Southeast Asian origin. Canadian Medical Association Journal, 1987; 137(1): 39-42 Sanchaisuriya K, Fucharoen G, N. Sae-ung, Jetsrisuparb A. Fucharoen S. Molecular and hematologic features of hemoglobin E heterozygotes with different forms of a-thalassemia in Thailand Ann Hematol 2003; 82(10): 612-616 Saunthararajah Y, Vichinsky EP, Embury SH: Sickle cell disease. Hematology Basic Principles and Practice. 4th edition. 2005, 605-634 Wang WC: Sickle cell anemia and other sickling syndromes. Wintrobe’s Clinical Hematology. 2th edition 2004, 1263-1296. 54