PapilloCheck - Greiner Bio-One
Transkript
PapilloCheck - Greiner Bio-One
4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir hr-HPV DNA-Chip PapilloCheck® high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 seMBoLLer sÖZLÜĞÜ tr Karanlık yerde saklayınız Son kullanma tarihi: Kullanmadan önce talimatı okuyun Katalog numarası Üretici firma In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü Sıcaklık sınırlaması içeriği <n> test için yeterlidir P V kodu D N A - Önemli Chip Tahriş h r - HParti edici Not en Store in the dark Use by Consult Instructions For Use Catalog Number Manufacturer In Vitro Dianostic Medical Device Temperature limitation contains sufficient for <n> tests Irritant Batch code Important Note de Im Dunkeln lagern Mindestens haltbar bis Vor Gebrauch Anweisung lesen Katalognummer Hersteller In-VitroDiagnostika Medizinprodukt Temperaturbegrenzung Inhalt ausreichend für <n> Tests Reizend Chargenbezeichnung Wichtiger Hinweis fr À stocker à l'abri de la lumière Date limite de conservation jusqu'au lire les instructions avant utilisation Numéro de référence Fabricant Produit médical de diagnostic in-vitro limite de température Contenu suffisant pour <n> tests irritant Code du lot Note importante es Conservar en un lugar oscuro A utilizar preferiblemente antes de Antes de usar, lea las instrucciones Número de catálogo Fabricante Producto medicinal de diagnóstico in vitro limitación de temperatura Contenido suficiente para <n> ensayos Irritante Código de lote Nota importante it Conservare al buio Da utilizzare entro e non oltre leggere le istruzioni prima dell'uso Numero catalogo Produttore Dispositivo medicodiagnostico in-vitro limitazione temperatura Contenuto sufficiente per test <n> Irritante Codice del lotto Nota importante pt Conservar num local escuro A utilizar preferívelmente antes de Antes de usar, leia as instruções Número de catálogo Fabricante Producto medicinal de diagnóstica in vitro PapilloCheck high-risk limitação de temperatura Conteúdo suficiente para <n> ensaios irritante Código do lote Aviso importante nl kullanım kılavuzuna Bakınız Xn ® Donker bewaren Tenminste houdbaar tot Gebruiksaanwijzing lezen Catalogusnummer Fabrikant In vitro diagnostisch medisch product Temperatuurbeperking Voldoende inhoud voor <n> tests Irriterend lot nummer Belangrijke opmerking da Opbevares mørkt Anvendes senest Læs brugsanvisningen Katalognummer Producent In vitro meskdicin doagnoseapparat Temperaturbegraensær Indeholder nok til <n> test lokalirriterende lotnummer Vigtig henvisning sv Förvaras mörkt. Sista förbrukningsdag läs brukKatalogTillverkare In vitroTempeInnehållet irriterande lot sanvisnin- nummer medicinsk ratur-beräcker till nummer gen före doaggränsning <n> tester servikal numunelerde 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan använd- 16, 18, 31, 33, 35, 39, nostisk ning papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine apparatur yönelik tanı kiti Viktigt meddelande pl Przechow- Termin ywa ć w zydatności reF 505 060 ciemności Ważne 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir ! no Przed użyciem przeczytać instrukcję Numer katalogowy Producent Ograniczenie temperatury Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından Oppbeva- holdbar til les katalogprodusent in vitro-di- tempein-vitro kullanılması res mørkt tanılarda bruksannummeriçindir agnostisk raturbevisning før bruk el Diagnostyka in vitro Produkt yw Αποθηκεύεται στα σκοτεινά το λιγότερο διατηρείται πριν την χρήση διαβάστε τις οδηγίες Αριθμός Καταλόγου Παραγωγός medisinsk utstyr grensning In vitro διαγνωστικά ιατρικά προϊόντα περιoριoμός θερμοκραο ίας greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 Zawartość wystarcza na <n> testów drażniący Innhold tilstrekkelig for <n> tester irriterende Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ ερεθιστικό Kod partii revizyon: BQ-065-01 batch nr. Viktig Ağustos merknad 2011 κωδικός παρτίδας Σημαντική υπόδειξη 2 iÇiNDekiLer 1. kiTiN iÇeriĞi ................................................................................................................ 5 h r - H P V D N A - C h i p6 2. gerekLi sArF MALZeMeLeri, ekiPMANLAr Ve DoNANIMLAr ........................ 3. NAkLiYe Ve sAkLAMA ............................................................................................... 8 4. gÜVeNLik TALiMATLArI ............................................................................................ 8 5. ATIkLArIN Yok eDiLMesi .......................................................................................... 9 6. giriŞ ............................................................................................................................ 10 6.1 kullanım amacı ............................................................................................................................... 10 6.2 PapilloCheck® high-risk ile saptanabilir hPV tipleri .................................................................... 10 6.3 Miktar tayini prensibi ..................................................................................................................... 11 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir 6.4 PapilloCheck® high-risk DNA çipinin tasarımı.............................................................................. 13 6.4.1 PapilloCheck® high-risk çipi yerleşim planı ......................................................................... 13 6.4.2 Çip üstü kontroller ................................................................................................................ 14 7. PAPIlloCheCk® hIgh-rIsk iŞ AkIŞI TALiMATLArI ............................................. 15 7.1 genel talimatlar .............................................................................................................................. 15 7.2 oda ayrımı....................................................................................................................................... 15 7.3 Uyarılar ve önlemler ....................................................................................................................... 16 ® 7.3.1 Kontaminasyonun önlenmesi ............................................................................................... 16 7.3.2 DNA çipleri ile işlem yapma talimatı ..................................................................................... 16 7.3.3 Genel önlemler..................................................................................................................... 16 7.3.4 Güvenli çalışma ................................................................................................................... 17 PapilloCheck high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız 8. PAPIllOCheCk® hIgh-rIsk ProseDÜr ............................................................... 18 8.1 Örnek toplama ve DNA izolasyonu ............................................................................................... 18 8.1.1 Örnek toplama ..................................................................................................................... 18 8.1.2 DNA izolasyonu.................................................................................................................... 20 Xn 8.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCr) ............................................................................................... 21 8.2.1 Termal döngüleyici kurulumu ............................................................................................... 21 servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan 8.2.2 Urasil-N-Glikosilaz (UNG) uygulaması yönelik ................................................................................ 22 papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine tanı kiti 8.2.3 PCR reaksiyon kurulumu ..................................................................................................... 23 8.3 hibridizasyon ve yıkama ............................................................................................................... 25 reF 505 060 8.3.1 Hazırlama ve kurulum .......................................................................................................... 25 Yalnızca laboratuar personeli tarafından revizyon: BQ-065-01 8.3.2 profesyonel Hibridizasyon ....................................................................................................................... 27 in-vitro kullanılması içindir Ağustos 8.3.3 tanılarda Yıkama ve kurutma .............................................................................................................. 29 2011 8.4 PapilloCheck® high-risk çipinin taraması ve değerlendirmesi ................................................... 31 greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 3 9. sorUN giDerMe ....................................................................................................... 32 10. TekNik YArDIM ......................................................................................................... 33 11. PAPIlloCheCk® hIgh-rIsk PerForMANs ÖZeLLikLeri.................................. 34 h r - H P V D N A - C h i34 p 11.1 PapilloCheck® high-risk’in analitik performansı .......................................................................... 11.1.1 Analitik hassasiyet ............................................................................................................... 34 11.1.2 Analitik özgüllük – HPV türleri .............................................................................................. 35 11.1.3 Analitik özgüllük – HPV dışı organizmalar ........................................................................... 35 11.2 Tekrarlanabilirlik ............................................................................................................................. 36 11.3 Yeniden Üretilebilirlik..................................................................................................................... 37 11.4 Dayanıklılık ..................................................................................................................................... 38 11.5 PapilloCheck® high-risk'in klinik Performansı ............................................................................. 39 12. PAPIlloCheCk® hIgh-rIsk kIsA ProTokoL ...................................................... 40 12.1 oda 2: PCr - reaksiyon karışımının kurulumu ........................................................................... 40 12.2 oda 2: PCr - DNA şablonu ekleme / PCr reaksiyonu ............................................................... 41 12.3 oda 3: hibridizasyon - hazırlama / hibridizasyon reaksiyonu................................................... 42 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir 12.4 oda 3: Yıkama ve kurutma / Tarama ve değerlendirme .............................................................. 43 PapilloCheck® high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 4 1. kiTiN iÇeriĞi 1 2 3 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir 4 PapilloCheck® high-risk test kiti1 içerik Miktar PCR MasterMix 5 x PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix2 5 x 300 µl Slide kutusu, 5 x 12 Dizi 1 x PapilloCheck® high-risk Slide Kutusu 5 PapilloCheck® high-risk çipi ile3 5 x 12 Dizi Hibridizasyon Tamponu 2 x PapilloCheck® high-risk Hibridizasyon Tamponu4 2 x 1.000 µl TAMPON A konsantrasyonu 2 x PapilloCheck® high-risk Tampon A konsantratı 2 x 40 ml TAMPON B konsantrasyonu 1 x PapilloCheck® high-risk Tampon B konsantratı 1 x 15 ml hr-HPV DNA-Chip Bir PapilloCheck® high-risk test kiti, 60 numunenin analizi için yeterlidir. DNA Taq Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz dışında PCR için gerekli olan tüm bileşenleri içerir. Flakon etiketlerinde PapilloCheck® high-risk, PapilloCheck® hr. olarak kısaltılmış şekilde bulunmaktadır. Bir PapilloCheck® high-risk çipi 12 PapilloCheck® high-risk mikrodizisi içerir. PapilloCheck® high-risk çip barkodları üzerinde, PapilloCheck® high-risk, PapilloCheck® hr. olarak kısaltılmış şekilde bulunmaktadır. Flakon etiketlerinde PapilloCheck® high-risk, PapilloCheck® hr. olarak kısaltılmış şekilde bulunmaktadır. PapilloCheck® high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 5 2. gerekLi sArF MALZeMeLeri, ekiPMANLAr Ve DoNANIMLAr PapilloCheck® high-risk'in listelenen sarf malzemeleri, ekipmanlar ve donanımlar ile birlikte ve yalnızca profesyonel personel tarafından kullanılması önerilmektedir. hr-HPV DNA-Chip sarf Malzemeleri greiner Bio-one kat. No. Miktar PapilloCheck® high-risk test kiti 505 060 60 reaksiyon için test kiti PapilloCheck® Toplama Kiti 465 070 10 numune oCheck® DNA izolasyon Kiti / Tek Kolon Hazırlama 515 040 50 hazırlama için test kiti oCheck® DNA izolasyon Kiti / 8 Kolon Hazırlama 515 050 12 x 8 hazırlama 765 288 774 288 772 288 739 288 750 288 96/960 96/960 96/960 96/960 60/600 616 201 683 201 673 210 373 270 500/4000 500/1000 125/1250 125/1250 210 261 25/450 steril, DNase içermeyen mikropipet filtre ucu1 0,5-10 µl filtre uçları 0,5-20 µl filtre uçları 10-100 µl filtre uçları 10-200 µl filtre uçları 100-1000 µl filtre uçları Avusturya'da üretilmiştir DNase-içermeyen reaksiyon tüpleri IVD Reaksiyon tüpü 1.5 ml Reaksiyon tüpü 0,2 ml2 8 x 0,2 ml PCR şeritleri 8 x 0,2 ml PCR şeritleri için kapak şeritleri PapilloCheck high-risk 50 ml polipropilen tüp3 ® Pipetleyici için plastik pipetler kullanım kılavuzuna Bakınız 4° 8° Pipet 10 ml Pipet 25 ml Pipet 50 ml 1 2 3 607 180 veya 607 160 760.180 veya 760.160 786.180 veya 768.160 1/200 1/200 1/200 Belirtilen uç boyutlarından bazıları kullanılabilir mikropipetlere bağlı olarak isteğe bağlıdır. Prensip olarak 8'li tüp PCR şeridi kullanılması önerilmektedir. Şeritler mevcut değilse tekli reaksiyon tüpleri (0,2 ml) isteğe bağlıdır. Yalnızca slide santrifüj mevcut değilse gerekir. servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 6 ekipman greiner Bio-one kat. No. Miktar 862 070 1 CheckReportTMYazılımı Temel 862 080 / 862 0904 1 CheckReportTMYazılımı PapilloCheck® high-risk eklentisi 862 088 / 862 0984 1 Slide tutuculu oCheck® Hibridizasyon Odası 447 070 hr-HPV D 1N A - C h i p Slide tutucu kolu 447 001 1 oCheck® Yıkama Teknesi5 447 020 1 oCheck® VacSet6 863 080 1 oCheck® VacPump6 863 070 1 CheckScannerTM gerekli enzimler • Taq Polimeraz: HotStarTaq® DNA Polimeraz 5 U/µl (Qiagen; 203203, 203205, 203207, 203209) • Urasil-N-Glikosilaz: Urasil-DNA Glikosilaz 1 U/µl (Fermentas; #EN0361, #EN0362) gereken ek sarf malzemeleri • PCR-kalitesinde su • Distile veya deiyonize su • Tek kullanımlık eldivenler Avusturya'da üretilmiştir gereken ek ekipmanlar IVD • 1.5 ve 2 ml reaksiyon tüpleri için mikrosantrifüj • 50 ml polipropilen tüpler için santrifüj (örn: BeckmanCoulter; Allegra X-22 Santrifüj; C0650 Sabit Açılı Rotor) veya slide santrifüj (örn: labnet: Slide Spinner; VWR International: Galaxy MiniArray Santrifüj) • Tekli 0,2 ml reaksiyon tüpleri veya 8'li tüp PCR şeritleri için mikrosantrifüj (örn: labnet: Spectrafuge Mini Santrifüj) • PCR termal döngüleyici: GeneAmp® PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) veya Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal işlemci (Uygulamalı Biyosistemler) ® • Su banyosu (50 °C) • Mikropipetler (1 - 1000 µl arası farklı aralıklar) • 8-Kanallı multipipet (aralık: 5 - 50 µl), örn. Brand Transferpette®-8 (Marka) • Cam ve plastik pipetler için pipetleyici • Vortex çalkalayıcı • Farklı reaksiyon tüpleri için raflar PapilloCheck high-risk 4° 8° kullanım kılavuzuna Bakınız gerekli ek donanımlar • Bilgisayar (sistem gereksinimleri için CheckScannerTM ve CheckReportTMYazılımı Kullanım Kılavuzuna bakınız) 4 5 6 CheckReportTM Software'in iki adet sürümü vardır. Cat. No. 862 090 / 862 098, 21CFR 11. Kısım gerekliliklerini de yerine getirmektedir. ® ® PapilloCheck yıkama prosedürü adet teknesi gerekmektedir. servikalhigh-risk numunelerde 16, 18, için 31, üç 33, 35,oCheck 39, 45,Yıkama 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan Yalnızca Kat. No. 515 050 ile birlikte kullanıldığında gereklidir. papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 7 3. NAkLiYe Ve sAkLAMA PapilloCheck® high-risk test kitinin nakliyesi oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Bununla birlikte kit teslim alındıktan hemen sonra 4-8 °C'de saklanmalı ve ışıktan korunmalıdır. Doğru bir şekilde saklanan PapilloCheck® high-risk test kiti ve bileşenleri belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Ayrıca bu koşullar altında raf ömrü, kitin ve bileşenlerinin ilk kez açılmasından sonra son kullanma hr-HPV DNA-Chip tarihinden sapmaz. 4. gÜVeNLik TALiMATLArI PapilloCheck® high-risk test kiti yalnızca laboratuar kullanımına yöneliktir ve ilaç, evsel veya diğer amaçlar doğrultusunda kullanım için tasarlanmamıştır. Her zaman uygun bir laboratuar önlüğü giyin, tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlük takın ve bu bölümde verilen güvenlik talimatlarını izleyin. PapilloCheck® high-risk test kitinin aşağıdaki bileşenleri zararlı veya tehlikeli bileşenler içerir. IVD Avusturya'da üretilmiştir Bileşen hibridizasyon Tamponu Tampon B Tehlike Ürün içeriği Tehlike sembolü Guanidin tiyosiyanat (% 25-60 ) <% 20 Sodyum Dodesilsülfat risk ifadeleri risk ifadeleri güvenlik ifadeleri Zararlı* R 20/21/22 R 32 R 52/53 S13 S61 S36/37 Tehlikeli* R 21/22 R 36/37/38 S26 S36/37 PapilloCheck high-risk ® 4° 8° * 125 g veya ml'ye kadar olan küçük ambalajlar için tehlike etiketine gerek yoktur (67/548//EEC Md. 25, 1999/45/EC Md. 12 ve German GefStoffV § 20 (3) ve TRGS 200 7.1 uyarınca). Daha fazla bilgi için bkz. Güvenlik Veri Formu. kullanım kılavuzuna Bakınız risk ifadeleri R 21/22 Ciltle teması veya yutulması zararlıdır R 20/21/22 Solunması, ciltle teması veya yutulması zararlıdır R 32 Asitlerle temasında çok toksik gaz çıkarır R 36/37/38 Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder R 52/53 Sudaki organizmalar için zararlıdır, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir Xn güvenlik ifadeleri S13 Yiyeceklerden, içeceklerden ve hayvan yemlerinden uzak tutun S26 servikal Gözlerle temas etmesi16, durumunda derhal yıkayın tıbbi alıninsan numunelerde 18, 31, gözleri 33, 35, 39, bol 45,suyla 51, 52, 56,ve 58, 59,yardım 66, 68 S36/37papillomavirüs Uygun koruyucu giysi giyin ve eldiven takın tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti S61 Çevreye salınmasından kaçının. Özel kullanım talimatına/güvenlik veri formuna bakın. reF 505 060 Bu ürüne ait güncel Güvenlik Veri Formu, Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir: www.gbo.com/bioscience/biochips_download Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından revizyon: BQ-065-01 in-vitro tanılarda kullanılması içindir Ağustos 2011 greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 8 5. ATIkLArIN Yok eDiLMesi PapilloCheck® high-risk çipi yıkandıktan ve kurutulduktan sonra yıkama çözeltileri I, II ve III özel bir tedbir olmaksızın atılabilir. Kullanılmış PapilloCheck® high-risk çipi, kullanılmamış kit bileşenlerini ve kullanılmamış hibridizasyon karışımını laboratuar kimyasal atıklarıyla birlikte bertaraf edin. Bertaraf etme ile ilgili tüm ulusal düzenlemelere, devlet düzenlemelerine ve yerel düzenlemelere riayet edin. 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir hr-HPV DNA-Chip PapilloCheck® high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 9 6. giriŞ Hemen hemen tüm rahim boynu kanseri vakalarında karsinojenik insan papillomavirüs (HPV) ile kalıcı enfeksiyon tespit edilmiştir – ikincisi tüm dünyada kadınlarda en yaygın görülen kanserdir. Bugüne kadar 100'den fazla HPV tipi saptanmıştır, bunların yaklaşık 40 tanesi cinsel yolla bulaşır ve genital mukozayı enfekte eder. Rahim boynu HPV tipleri hem yüksek risk (yüksek riskli HPV, hrHPV) hr-HPV DNA-Chip hem de düşük risk grubunda (düşük riskli HPV, lrHPV) sınıflandırılır. Yüksek riskli HPV tipleri yüksek rahim boynu kanseri riski ile ilişkiliyken düşük riskli HPV tipleri çoğunlukla iyi huylu genital siğillere neden olur. Bununla birlikte, yüksek risk grubunda dahi kanser veya rahim boynu interepitelyal lezyonların (CIN) görülme riski tipe bağlıdır. Tüm rahim boynu kanser vakalarının yaklaşık % 70'i HPV 16 veya 18 ile bağlantılı kalıcı enfeksiyon ile ilişkilidir. En çok rastlanan düşük risk tipleri HPV 6 ve 11'dir. Karsinojenik HPV ile rahim boynu kanseri arasındaki hemen hemen kesin olan etyolojik ilişkiye göre hrHPV'nin test edilmesi birincil rahim boynu kanser taraması için düşünülmektedir. 6.1 kullanım amacı PapilloCheck® high-risk, in Vitro Tıbbi Tanı Cihazları Direktifinin (98/79/EC) koşullarına uyduğundan dolayı CE uyum işareti taşımaktadır. PapilloCheck® high-risk kullanılarak elde edilen her tanı sonucu diğer klinik bulgular veya laboratuar bulguları ile birlikte yorumlanmalıdır. 6.2 4° PapilloCheck® high-risk ile saptanabilir hPV tipleri ® PapilloCheck high-risk PapilloCheck® high-risk insan papillomavirüsünün kanserojen açıdan yüksek risk taşıyan 14 tipinin (hrHPV) saptanmasına olanak tanır. (Tablo 1). kullanım kılavuzuna Bakınız 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir PapilloCheck® high-risk bir tanı kitidir ve insan rahim boynu smear'larından alınan DNA preparatlarında 14 türde genital yüksek riskli insan papillomavirüsünün (hrHPV) kalitatif tespiti ve genotiplemesinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Kitin yalnızca uygun niteliklere sahip personel tarafından kullanılması amaçlanmıştır. Tablo 1: PapilloCheck® high-risk ile saptanabilir hPV tipleri hPV 16 hPV 51 hPV 18 hPV 52 hPV 31 hPV 56 hPV 33 hPV 58 hPV 39 hPV 66 hPV 45 hPV 68 servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan hPV 35 hPV 59 papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti reF 505 060 Xn Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir 1 2 3 4 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1):12-9. Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1–17. Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specificimplications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K1-16. gmbh Meijer, C.J. et al. (2009).greiner GuidelinesBio-one for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer. Maybachstr. 124(3):516-20. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 10 6.3 Miktar tayini prensibi PapilloCheck® high-risk, insan papillomavirüs (HPV) genomu E1 geninin bir parçacığının tespit edilmesine ve genotiplemesine yönelik mikrodizi tabanlı bir test kitidir. Miktar tayini prosedürü Şekil 1'de özetlenmiştir. hr-HPV DNA-Chip DNA izole PapilloCheck® high-risk analizinden önce bir rahim boynu smear'i numunesinden ® edilmelidir. Numune toplama ve DNA izolasyonu PapilloCheck high-risk test kitinin parçaları değildir. Greiner Bio-One numune toplama (PapilloCheck® Toplama Kiti) ve DNA izolasyonuna (oCheck® DNA izolasyon Kiti) yönelik özel ürünler de sunmaktadır ve bu ürünler ayrı olarak satın alınmalıdır (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız). 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir Bir rahim boynu numunesinden viral ve insan genomik DNA'sının izolasyonundan sonra viral E1 geninin 350 bp'lik parçacığı HPV'ye özgü primerler grubunun bulunduğu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edilir. Aynı reaksiyonda insan tek kopya geni ADAT1 (insan tRNA-özgül adenozin deaminaz1), rahim boynu numunesinde insan numunesi materyalinin varlığını (numune kontrolü) ve PapilloCheck® high-risk'de bulunan dahili kontrol şablonunu izlemek için amplifiye edilir. PCR MasterMix, PCR (PCR kontrolü) performansını izlemek için amplifiye edilir. Ayrıca PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix, dUTP içerir. Böylece, önceki PCR reaksiyonlarından kaynaklanan taşınma kontaminasyonu Urasil-N-Glikosilaz (UNG) uygulaması ile giderilebilir (bkz. bölüm 8.2.2). PCR ürünleri daha sonra spesifik DNA problarına hibridize edilir ve PapilloCheck® high-risk çip yüzeyine çip üstü kontrolleri eklenir. Her çip 12 DNA-mikrodizisi içerir, 12 rahim boynu numunesinin eş zamanlı analizine olanak tanır. Hibridizasyon sırasında bağlı DNA floresanla etiketlenir ve bağı çözülmüş DNA sonraki yıkama adımlarında çıkarılır. Hibridizasyon etkinliği izlenir (hibridizasyon kontrolü). Son olarak PapilloCheck® high-risk çipi sırasıyla CheckScannerTM ve CheckReportTM Yazılımı kullanılarak otomatik olarak taranır, analiz ® edilir ve değerlendirilir (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız). CheckScannerTM, iki renkli lazer tarayıcısı olup (532 nm ve 635 nm eksitasyon dalgaboyları) HPV'ye özgü amplifikasyon ürünlerinin yanı sıra kontrollerinin varlığı ile oluşturulan floresan sinyalinin tespit edilmesini sağlar (bkz. bölüm 6.4.2). CheckReportTM Yazılımı, sonuçların görüntülenmesine, analizine ve değerlendirilmesine olanak sağlar ve tespit edilen HPV türlerinin ve kontrollerin ilgili değerlerini ayrıntılı bir raporda otomatik olarak gösterir. PapilloCheck high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız Rapor, tespit edilebilir bir veya daha fazla 14 yüksek riskli HPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça gösterir ve kapsamlı çip üstü kontrolleri analizi son derece güvenilir kılar. servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 11 1. PCr reaksiyonu hr-HPV DNA-Chip 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir 2. hibridasyon 3. Yıkama ve kurutma PapilloCheck® high-riskveya kullanım kılavuzuna Bakınız 4. Tarama ve analiz servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından tanılarda kullanılması içindir ® Şekil 1:in-vitro PapilloCheck high-risk miktar tayini prosedürü revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 1. PCr reaksiyonu: DNA izolasyonundan sonra viral E1 geninin 350 bp'lik parçacığı ve iki kontrol hedefinin parçacıkları PCR ile amplifiye edilir. Amplifikasyon ürünleri daha sonra çip üzerinde tamamlayıcı DNA problarına hibridize edilir. 2. hibridasyon: Her bir HPV türü, beş kopya halinde bulunan spesifik DNA probu ile tespit edilir. Hibridizasyon sırasında floresan etiketleme uygulanır. 3. Yıkama ve kurutma: Bağı çözülmüş DNA sonraki yıkama adımlarında çıkarılır. ® 4. Tarama ve analiz: greiner PapilloCheck high-risk çipi CheckScannerTM ve CheckReportTMYazılımı kullanılarak taranır, analiz Bio-one gmbh edilir ve değerlendirilir. Tespit edilebilir bir veya daha fazla 14 HPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça gösteren bir Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya rapor oluşturulur. Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 12 6.4 PapilloCheck® high-risk DNA çipinin tasarımı 6.4.1 PapilloCheck® high-risk çipi yerleşim planı Her PapilloCheck® high-risk çipi, kuyucuk A1 - B6 olarak tayin edilmiş 12 mikrodizi içerir. Her PapilloCheck® high-risk mikrodizisi 28 farklı probdan oluşur ve yükseltilmiş bir alanla sınırlanır. Her hr-HPV DNA-Chip gösterilmekte prob beş kez damlatılır. PapilloCheck® high-risk mikrodizi yerleşim planı Şekil 2'de ve-çip üstü kontrolleri Bölüm 6.4.2'de daha detaylı bir şekilde açıklanmaktadır. kırmızı kanalın (635 nm) oryantasyon kontrolü hibridizasyon kontrolü HPV 16 HPV 51 HPV 18 HPV 52 HPV 31 HPV 56 HPV 33 HPV 58 HPV 35 HPV 59 HPV 39 HPV 66 HPV 45 HPV 68 numune kontrolü PCR kontrolü yeşil kanalın (532 nm) a) oryantasyon kontrolü hibridizasyon kontrolü HPV 16 HPV 51 HPV 18 HPV 52 HPV 31 HPV 56 HPV 33 HPV 58 HPV 35 HPV 59 HPV 39 HPV 66 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir b) c) PapilloCheck® high-risk HPV 45 HPV 68 numune kontrolü PCR kontrolü Şekil 2: PapilloCheck® high-risk çipinin tasarımı a) PapilloCheck® high-risk çipinin şematik çizimi. b) ve c) (b) kırmızı kanalın: 635 nm; c) yeşil kanalın: 532 nm taranmasında kullanılan iki farklı eksitasyon dalgaboyu için CheckReportTM Yazılımı ve PapilloCheck® high-risk mikrodizi yerleşim planının şematik çizimleri. HPV türü spesifik problar ve çip üstü kontroller belirtilir. kullanım kılavuzuna Bakınız servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 13 6.4.2 Çip üstü kontroller PapilloCheck® high-risk DNA-çipinin tasarımı kapsamlı çip üstü kontrolleri içerir. Çeşitli kontrol sistemleri, numune kalitesi ve DNA izolasyonu (numune kontrolü), PCR reaksiyonunun kalitesi (PCR kontrolü), hibridizasyon etkinliğinin (hibridizasyon kontrolü) yanı sıra nokta homojenliği ve baskı kalitesi (işletim kontrolü ve baskı kontrolü) de dahil olmak üzere miktar tayini ve çip işlemenin hr-HPV DNA-Chip tüm kritik adımlarını izler. HPV türlerinin varlığına veya yokluğuna ek olarak CheckReport™Yazılımı kontrollerin ve tespit edilen HPV türlerinin ilgili değerlerini ayrıntılı bir raporda gösterir. Farklı kontrollerin okunması için CheckScanner™'in her iki eksitasyon dalgaboyu kullanılır. Miktar tayini performansının kontrolü için (numune ve PCR kontrolü) kırmızı kanal kullanılırken (635 nm eksitasyon dalgaboyu), hibridizasyonun ve çipin kalitesi (hibridizasyon, oryantasyon ve baskı kontrolü) yeşil kanalda değerlendirilir (532 nm eksitasyon dalgaboyu). Numune kontrolü PapilloCheck® high-risk, insan tek kopya geni ADAT1'in (insan tRNA-spesifik adenozin deaminaz1) bir parçacığını amplifiye ederek numunenin numunenin ve/veya DNA izolasyonunun kalitesini izler. insan DNA'sı rahim boynu numunesinden izole edilen DNA'da yeterli miktarda mevcut ise numune kontrol noktalarında bir floresan sinyali verilir. 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir ADAT1 amplifikasyonu gerçekleşmez veya yetersiz şekilde gerçekleşirse, CheckReport™Yazılımı numune kontrolünün "başarısız" olduğunu gösterecektir ve rahim boynu numunesinde yetersiz miktarda hücre olmasının ve/veya yetersiz izolasyon performansının bir sonucu olarak analizi tekrarlanmalıdır (bkz. Bölüm 9). PCr kontrolü PapilloCheck® high-risk ayrıca PCR reaksiyonunun kalitesini de izler. PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix'de bulunan dahili kontrol şablonunun amplifikasyonu PapilloCheck® high-risk çipindeki PCR kontrol noktalarında bir sinyal oluşturur. Amplifikasyon reaksiyonunun kalitesi aynı zamanda CheckReport™Yazılımı ile de otomatik ® olarak değerlendirilir. PCR performansı önceden tanımlanmış eşiğin altında ise CheckReport™Yazılımı PCR kontrolünü "başarısız" olarak gösterir ve analiz tekrarlanmalıdır (bkz. Bölüm 9). PapilloCheck high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız Numunedeki HPV DNA çok yüksek ise, PCR kontrol noktalarının floresan sinyali, PCR reaksiyonu sırasındaki rekabete bağlı olarak düşük olabilir veya olmayabilir. Bu durumda testin geçerli olarak kabul edilebilmesi için en az bir HPV-spesifik probunun floresan sinyali önceden tanımlanmış eşiği aşmalıdır. Xn hibridizasyon kontrolü PapilloCheck® high-risk, PapilloCheck® high-risk çipinde spesifik DNA dizilerine hibridize olan PapilloCheck® high-risk Hibridizasyon Tamponu içinde floresan ile etiketlenmiş prob kullanımı ile hibridizasyonun etkinliğini izler. Yeterli bir hibridizasyon etkinliği her bir dizi noktasında floresan servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan sinyalleri ile sonuçlanır. PapilloCheck® high-risk çipindeki beş hibridizasyon kontrol noktasının papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti sonuçları ayrıca CheckReportTMYazılımı ile de değerlendirilir. reF 505 060 oryantasyon ve baskı kontrolü PapilloCheck® high-risk çipinin oryantasyon kontrol noktaları, hibridizasyon prosesinin etkinliğine Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından revizyon: BQ-065-01 bakılmaksızın floresan sinyalleri verir. Bu noktalar, sinyallerin doğru analizi için bir ön koşul olan in-vitro tanılarda kullanılması içindir Ağustos 2011 doğru nokta tespitine yönelik kılavuz noktaları olarak CheckReportTMYazılımı tarafından kullanılır. Ayrıca baskı prosesinin kalitesi her bir çip noktasında (baskı kontrolü) yeşil bir floresan sinyali ile izlenir. greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 14 7. PAPilloCheCk® high-risk iŞ AkIŞI TALiMATLArI 7.1 genel talimatlar Moleküler biyolojide halihazırda kullanılan en gelişmiş teknikler bir laboratuvara uygulandığında, laboratuar personelinin azami güvenliğini ve yüksek kaliteli sonuçlar sağlamak amacıyla aşağıdaki hr-HPV DNA-Chip talimatlar göz önünde bulundurulmalıdır. DNA izolasyonu, amplifikasyon ve amplifikasyon ürünlerinin tespiti uygun nitelikli personel gerektirir. Ayrıca DNA bozunması veya amplifikasyon ürünleri ile kontaminasyon nedeniyle ortaya çıkanlar gibi hatalı sonuçları engellemek için net ve iyi yapılandırılmış bir iş akışı gerekmektedir. Bunu sağlamak için Bölüm 7.2'de tanımlandığı gibi izolasyon, amplifikasyon ve tespit alanlarının ayrılması gerekir. Her alanda ayrı ekipman, sarf malzemeleri, laboratuvar önlükleri ve eldivenler bulunmalıdır. laboratuvar önlüklerini, eldivenleri veya ekipmanları kesinlikle farklı bir alandan bir başka alana aktarmayın. oda ayrımı Şekil 3bir laboratuvarın nasıl 3 farklı bölüme ayrılabileceğine yönelik bir örnek göstermektedir. Bu odalardan biri yalnızca DNA izolasyonu için, diğeri PCR reaksiyonlarının kurulması ve çalıştırılması için, sonuncusu ise hibridizasyon ve analiz için kullanılır. Her bir oda, numunelerin kontaminasyonunu önlemek amacıyla, yalnızca belirtilen uygulama veya teknik için kullanılır. Ekipmanların ve sarf malzemelerinin alanlar arasında yanlışlıkla yer değiştirmesini önlemek için renk kullanılması yararlı olabilir. ® PapilloCheck high-risk oda 1 oda 2 oda 3 kullanım kılavuzuna Bakınız 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir 7.2 Xn Şekil 3: oda ayrımı numunelerde 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan oda 1: servikal DNA izolasyon prosedürünün16, tamamı bu odada gerçekleştirilmelidir. oda 2:papillomavirüs Bu odada, PCR reaksiyon karışımı ayarlanır ve alikuotlara bölünür uygunu bir PCR ocağı altında). Oda 1'de tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı(en kiti izole edilen DNA numunelerinin eklenmesi oda 2 içinde ayrı bir alanda gerçekleştirilmelidir. oda3: Hibridizasyon reaksiyonu, yıkama adımları ve çip kurutma üçüncü laboratuvar odasında yapılır. Ayrıca reF 505 060 TM TM CheckScanner , CheckReport Yazılımı ile birlikte PapilloCheck® high-risk miktar tayininin nihai analizi için kullanılır. ! Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından revizyon: BQ-065-01 Ekipmanlar ve sarf malzemeleri, farklı laboratuvar odaları ve alanları arasında yer değiştirmemelidir. in-vitro tanılarda kullanılması içindir Ağustos 2011 Bu nedenle, laboratuvara ekipman temin edilirken ekipmanların ve sarf malzemelerinin çift olarak temin edilmesine dikkat edilmelidir. greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 15 7.3 Uyarılar ve önlemler 7.3.1 kontaminasyonun önlenmesi • Prosedürlerin uygulanması sırasında laboratuvar önlükleri giyilmelidir ve her bir laboratuvar odası için farklı laboratuvar önlük setleri bulunmalıdır. hr-HPV DNA-Chip • Analizin her adımında eldivenler takılmalıdır ve özellikle DNA izolasyonu sırasında sık sık değiştirilmelidir. • Çalışma yeri uygun temizlik solüsyonlarıyla dekontamine edilmelidir. • Reaksiyon tüpü kapağının içine kesinlikle dokunulmamalıdır. Çapraz kontaminasyondan kaçınmak için, her seferde yalnızca bir tüp açılmalıdır. • Aerosol bariyerli uygun mikropipet filtre uçları kullanılmalıdır (DNase, Rnase ve insan DNA'sı içermeyen). Sıvı transferleri arasında pipet uçları daima değiştirilmelidir. 7.3.2 DNA çipleri ile işlem yapma talimatı • DNA çipleri tozsuz bir ortamda kullanılmalıdır. Çip yüzeyinde toz ve diğer parçacıkların birikmesi önlenmelidir. • Çip yüzeyindeki hibridizasyon bölgesine dokunulmamalıdır. 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir • Çipin yalnızca etiketli tarafı hibridizasyona yöneliktir. • Çip üzerinde spesifik olmayan floresana yol açtıklarından DNA çiplerinin tanımlanması için işaret kalemleri kullanılmamalıdır. • DNA dizileri yalnızca tek kullanımlıktır. Hibridize edilen çipler yeni,den kullanılamaz. • Kullanılmamış çipler, teslim edilen ve nem çekici fermuarlı torba içinde, orijinal kutusunda saklanır. 7.3.3 ® PapilloCheck high-risk genel önlemler kullanım kılavuzuna Bakınız • Bu kit yalnızca in vitro tanılarda kullanıma yöneliktir ve yalnızca in vitro tanılarda laboratuvar uygulama deneyimine sahip eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır. • Teslim alındığında kit bileşenlerinin hasarlı olup olmadığını kontrol edin. Bileşenlerden biri hasar görmüşse (örn. tampon şişeleri), yerel Greiner Bio-One distribütörünüze başvurun. Hasar görmüş kit bileşenleri kullanılmamalıdır. Bu komponentlerin kullanılması, kit performansını zayıflatabilir. • PapilloCheck® high-risk test kiti, son kullanma tarihinden sonra kullanılmamalıdır. • Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. • Farklı serilere ait reaktifleri karıştırmayın. servikal 16, 18, 31, 33,tarafından 35, 39, 45,tavsiye 51, 52,edilen 56, 58, 59, 66, 68 insan kullanın. • Yalnızca kitlenumunelerde birlikte sağlanan ve üretici reaktifl eri/ekipmanları papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti • Mikropipetler, su banyosu ve termoblok için düzenli kalibrasyon/bakım gerçekleştirilmelidir. Xn • Mikrolitre aralığına küçük miktarlarda sıvı pipetlemek zordur. Bu nedenle olabildiğince doğru bir reF 505 060 şekilde pipetlemeye dikkat edin. • Reaktifl erin profesyonel mikrobik kontaminasyonunu önlemek için alikuotlar reaktif tüplerinden alınırken Yalnızca laboratuar personeli tarafından revizyon: BQ-065-01 dikkatli olunmalıdır. in-vitro tanılarda kullanılması içindir Ağustos 2011 • Tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir (18-25 °C). greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 16 7.3.4 güvenli çalışma • insanlara bulaşma potansiyeli taşıyan maddeler içeren biyolojik numunelerle işlem yaparken dikkatli olun. Bulaşma potansiyeline sahip maddelerden enfeksiyon alma riskini azaltmak için, numune lizisi tamamlanana kadar, laminar hava akımı şartları altında çalışmanız tavsiye edilir. Tüm biyolojik numuneleri, enfekte edici ajanlar taşıma kapasiteleri bulunuyormuş gibi kabul hr-HPV DNA-Chip ederek kullanın ve bertaraf edin. • Solüsyonları kesinlikle ağzınızla pipetlemeyin. • Çalışma alanlarında yiyecek ve içecek bulundurmayın, sigara içmeyin veya kozmetik ürünler kullanmayın. • Biyolojik numunelere doğrudan temas etmekten, bu numuneleri sıçratmaktan veya püskürtmekten kaçının. • insan numuneleriyle çalışırken daima laboratuvar önlüğü giyin, eldiven takın ve koruyucu gözlük kullanın. 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir • Numuneleri ve reaktifleri kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. PapilloCheck® high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 17 8. PapilloCheck® high-risk PROSEDÜR Aşağıdaki bölümde, her bir analiz edilen rahim boynu numunesinde tespit edilebilir bir veya daha fazla 14 yüksek riskli HPV türünün varlığını veya yokluğunu açıkça belirten ayrıntılı bir raporun hazırlanması ile sonuçlanan farklı çalışma adımları ayrıntılı bir şekilde açıklanmaktadır. Şekil 4, gerekli olan farklı çalışma adımlarına bir genel bakış sunar. Ayrıca spesifik miktar tayini adımının tanımlandığı ilgili alt bölümü de gösterir. Çalışma adımları bu bölümde belirtilen sırada gerçekleştirilmelidir. Her adım mavi ok ➠ile gösterilmiştir. ! CheckReportTM Yazılımı ile örnek toplama, DNA izolasyonu ve analiz PapilloCheck® high-risk test kitinin parçaları değildir. Bu nedenle bu çalışma adımlarının tanımı bu bölümde kısaltılmıştır. Daha ayrıntılı bilgi için lütfen Kullanım Kılavuzuna bakın, örn: PapilloCheck® Toplama Kitinden, oCheck® DNA İzolasyon Kiti ve CheckReportTM Yazılımından. 8.1 Örnek toplama ve DNA izolasyonu 8.1.1 Örnek toplama Örnek toplama, PapilloCheck® high-risk test kitinin bir parçası değildir. Greiner Bio-One tarafından rahim boynu örneklerine yönelik özel bir toplama kiti (PapilloCheck® Toplama Kiti) de sunulmaktadır (Bölüm 2'de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız). PapilloCheck® high-risk, aşağıdaki toplama sistemleri veya araçlarından biri ile toplanan insan rahim boynu smear'larından oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile hazırlanan DNA kullanılarak valide edilmiştir: • PapilloCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Almanya) • PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, ABD) • Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD) • STMTM (Qiagen, Hilden, Almanya). Uygun taşıma araçları veya DNA izolasyon sistemleri ile ilgili daha fazla bilgi için yerel Greiner BioOne distribütörünüz ile iletişime geçin veya Greiner Bio-One internet sitesine başvurun: www.gbo.com/bioscience/biochips_download 18 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 Bölüm 8.1.2 DNA izolasyonu Bölüm 8.2 PCR Bölüm 8.3.2 Hibridizasyon Bölüm 8.3.3 Yıkama ve kurutma or Bölüm 8.4. Tarama ve değerlendirme Şekil 4: Farklı PapilloCheck® high-risk çalışma adımlarına genel bakış 19 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 8.1.2 DNA izolasyonu DNA izolasyonu, PapilloCheck® high-risk test kitinin bir parçası değildir. PapilloCheck® high-risk analizinden önce Greiner Bio-One tarafından sağlanan oCheck® DNA İzolasyon Kiti (Bölüm 2^de bulunan sipariş verme bilgilerine bakınız) kullanılarak DNA izolasyonu gerçekleştirilmelidir. oCheck® DNA İzolasyon Kitini kullanırken lütfen Kullanım Kılavuzunu izleyin. oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile DNA izolasyonu için 250 µl numune çözeltisi kullanılmalıdır. Papill • oCheck® Toplama Kiti (Greiner Bio-One; Kat. No. 465 070) • PreservCyt® toplama ortamında kullanılarak toplanan insan rahim boynu semar numuneleri (Hologic, Bedford, MA, ABD) doğrudan işlenebilir. STM • toplama ortamında (BD, Franklin Lakes, NJ, ABD) toplanan rahim boynu numuneleri kullanım öncesi yıkanmalıdır: 250 µl numuneyi 11.000 g'de 5 dakika süreyle santrifüj edin ve pelleti 250 µl distile suda resüspanse edin. Daha sonra 250 µl oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir. TM STM • STMTM toplama ortamında (Qiagen, Hilden, Almanya) toplanan rahim boynu numuneleri seyreltilmelidir: 100 µl numune kullanın ve 150 µl distile su ekleyin. 250 µl seyreltilmiş numune oCheck® DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir. Genel olarak rahim boynu smear numunesi çok konsantre görünüyorsa ve zaten agrege olmuşsa, DNA izolasyonuna başlamadan önce numunenin seyreltilmesi ve homojenize edilmesi gerekir! Çok seyreltilmiş ve gözle görünür hücreleri göstermeyen rahim boynu smear numuneleri, DNA izolasyonu için daha fazla hücre verimi elde etmek amacıyla konsantre edilmelidir: 1000 µl numuneyi 11.000 g'de 5 dakika süreyle santrifüj edin ve pelleti 250 µl distile suda resüspanse edin. Daha sonra 250 µl oCheck®DNA İzolasyon Kiti ile işlenebilir. ! Bu konsantrasyon adımı yalnızca PapilloCheck® Toplama Kiti ile, PreservCyt® toplama ortamında veya SurepathTM toplama ortamında toplanan rahim boynu smear numuneleri için uygundur. STMTM toplama ortamı kullanılmışsa, santrifüj yoluyla konsantrasyon elde edilmesi mümkün değildir. 20 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 8.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) PCR, son derece küçük DNA miktarlarını tespit edebilen çok hassas bir yöntemdir. Reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için özel önlemlere uyulmalıdır (bkz. Bölüm 7). HotStarTaq® Polimeraz ve Ursail-N-Glikosilaz gerekir ancak PapilloCheck® high-risk test kiti ile birlikte verilmez ve ayrı olarak satın alınmalıdır (bkz. Bölüm 2). ! PapilloCheck® high-risk test kiti Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq® Polimeraz ve Fermentas tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak (Bölüm 2'de yer alan sipariş verme bilgilerine bakınız) valide edilmiştir. Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimlerin kullanılması zorunludur. 8.2.1 Termal döngüleyici kurulumu PapilloCheck® high-risk test kiti aşağıdaki termal döngüleyicilerle valide edilmiştir: • GeneAmp® PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) • Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler). ! Belirlenen performansın elde edilmesi için yukarıda belirtilen termal döngüleyicilerden birinin kullanılması kesinlikle şarttır. PapilloCheck® high-risk PCR'nin termal döngüleyici programı Tablo 2'de özetlenmektedir. Tablo 2: PapilloCheck® high-risk PCR'nin termal döngüleyici programı Süre Sıcaklık °C Döngü sayısı 20 dk. 37 ºC 1 15 dk 95 ºC 1 30 sn. 25 sn. 45 sn. 95 ºC 55 ºC 72 ºC 40 30 sn. 45 sn. 95 ºC 72 ºC 15 Tutun 10 °C Ayrıca her termal döngüleyici için aşağıdaki işlem parametreleri ayarlanmalıdır. Bu parametrelerin nasıl ayarlanması gerektiğinin açıklaması için ilgili termal döngüleyicinin Kullanım Kılavuzuna bakınız. GeneAmp® PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) Reaksiyon hacmini 26 µl'ye, rampa hızını “9600”e ayarlayın ve 103 °C kapak sıcaklığını kullanın. Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler) PapilloCheck® high-risk PCR programına girmek için Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyicinin Dönüştürme Yöntemi aracını kullanın ve “9600 Emülasyon Modu”nu seçin. Reaksiyon hacmini 26 µl'ye ve kapak sıcaklığını 103 °C'ye ayarlayın. 21 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 8.2.2 Urasil-N-Glikosilaz (UNG) uygulaması PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix, PapilloCheck® high-risk PCR sırasında amplifikasyon ürünlerine dahil edilen dUTP içerir ve PCR ürünlerini UNG ile bozunmaya duyarlı hale getirir. UNG, PCR ürününü deoksiuridilat kalıntısının dahil edildiği bölgelerde ayırır. Ayrık PCR ürünleri sonraki bir reaksiyonda amplifiye edilmez. Bu nedenle UNG uygulaması, önceki PCR kontaminasyonlarından taşınma kontaminasyonunu gidermek için kullanılabilir. ➠➠ PCR kalitesinde suda Urasil-N-Glikosilazı 1:200 seyreltin. Her PapilloCheck® high-risk PCR reaksiyon kurulumu için yeni bir UNG seyreltmesi kullanın (bkz. Bölüm 8.2.3). Seyreltilmiş UNG'yi yeniden kullanmayın. ➠➠ 2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru birçok kez pipetleyerek UNG seyreltmeyi karıştırın. Urasil-N-Glikosilaz orijinal konsantrasyonu 1 U/µl'dir. Sonuç olarak, seyreltmenin konsantrasyonu 0,005 U/µl'dir. ! PapilloCheck® high-risk test kiti Fermentas tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak valide edilmiştir (bkz. Bölüm 2). Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur. ➠➠ Bu seyreltmeden 1 µl her bir PapilloCheck® high-risk PCR reaksiyonuna ekleyin (bkz. Bölüm 8.2.3, Tablo 3). Bu miktar, PCR taşınma kontaminasyonunu gidermek için yeterlidir. PCR performansı üzerinde olumsuz bir etkisi olabileceğinden ve PapilloCheck® high-risk hassasiyetinin azalması ile sonuçlanabileceğinden daha yüksek konsantre edilmiş UNG solüsyonu kullanmayın. Genel olarak UNG uygulaması için PCR reaksiyon karışımı 37 °C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir. Daha sonra, UNG 95 °C'de 15 dakika süreyle ek inkübasyon adımı ile etkisizleştirilir. Bu iki adım PapilloCheck® high-risk PCR'ye zaten dahil edilmiştir ve termal döngüleyici programının ilk iki adımına karşılık gelir (bkz. Tablo 2). İkinci adımda (95 °C'de 15 dakika) Urasil-N-Glikosilaz'ın etkisizleştirilmesi ve HotStarTaq® Polimeraz etkinleştirmesi gerçekleşir. ! PapilloCheck® high-risk PCR'nin dahil edilen UNG sistemi yalnızca önceki PCR reaksiyonlarından PCR ürünleri ile taşınma kontaminasyonlarını giderir. Numune hazırlama, DNA izolasyonu veya PCR şablon ekleme sırasında meydana gelenler gibi diğer kontaminasyonlar giderilemez. Bu nedenle Bölüm 7'de tanımlanan kontaminasyonunun önlenmesi için talimatların ve özel önlemlerin izlenmesi hala gereklidir. 78 PapilloCheck® high-risk ürününü satın aldığınızda ürünle birlikte ABD Patent Numaraları 5,035,996; 5,683,896; 5,945,313; 6,287,823 ve 6,518,026 altında sınırlı bir lisans ve ilgili yabancı patentler gelir. 6 Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions, Gene, 93, 125-128, 1990. 5 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 22 8.2.3 PCR reaksiyon kurulumu HotStarTaq® Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz hariç olmak üzere PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix, PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için gerekli olan tüm bileşenleri zaten içermektedir (PCR tamponu, MgCl2, dNTP'ler, primerler, PCR kontrol şablonu). ! PapilloCheck® high-risk test kiti Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq® Polimeraz kullanılarak valide edilmiştir (bkz. Bölüm 2). Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur. Reaksiyon karışımının kurulumu, reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için en uygun bir biçimde PCR ocağı gibi korunan bir ortamda gerçekleştirilir. ➠➠ Reaksiyon karışımını (PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix, HotStarTaq® Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz'dan oluşur) Tablo 3'te belirtildiği gibi gerekli PCR miktarı için hazırlayın. Çoklu numuneleri analizi etmek için reaksiyon karışımı bir seri halinde hazırlanmalıdır (tüm analizler için gerekli olan miktarda). Pipetleme sırasında hacim varyasyonlarını düzenlemek için reaksiyonların sayısının her çip için (n) 1 arttırılması (=n+1) önerilir, örn: 12 numunenin test edilmesi gerekiyorsa 13 amplifikasyon reaksiyonu için bir reaksiyon karşımı hazırlayın (bkz. Tablo 3). Bir çipin reaksiyonları için her zaman bir MasterMix flakonu kullanın. ! PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix'in her serisi için bir negatif kontrolün dahil edilmesi önerilir. Negatif kontrol olarak uygun DNA izolasyon kitinin DNA elüsyon tamponu veya PCR kalitesinde su kullanılabilir. ➠➠ 2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru birçok kez pipetleyerek reaksiyon karışımını iyice karıştırın. ➠➠ Her bir PCR reaksiyonu için reaksiyon karışımının 21 µl'sini pipetleyerek 0,2 ml'lik, ince duvarlı PCR reaksiyon tüpüne alikuotlara bölün. Şablon DNA'yı reaksiyon karışımının kurulumundan ayrı bir çalışma alanına ekleyin (bkz. Bölüm 7.2). ➠➠ Her bir PCR reaksiyonuna 5 µl DNA ekstraktı ekleyin ve 2 saniye süreyle vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya birçok kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyerek karıştırın. Bir PCR reaksiyonunun toplam hacmi 26 µl'dir. ➠➠ Reaksiyon tüplerini termal döngüleyiciye yerleştirin ve Bölüm 8.2.1'de tanımlanan termal döngüleyiciyi kullanarak PCR reaksiyonunu başlatın (Tablo 2). ! PCR tamamlandıktan sonra amplifikasyon ürünleri hibridizasyon için hemen kullanılmalı veya bir hafta süreyle -20 °C'de saklanmalıdır. 23 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 Tablo 3: PapilloCheck® high-risk PCR reaksiyonunun kurulumu 1 reaksiyon 13 reaksiyon (1 çip) 26 reaksiyon (2 çip) 39 reaksiyon (3 çip) 52 reaksiyon (4 çip) PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl HotStarTaq® Polimeraz (5 U/µl) 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl Urasil-N-Glikosilaz (1:200 seyreltme, 0,005 U/µl) 1 µl 13µl 26 µl 39 µl 52 µl Numune DNA eklenmeden önce toplam hacim 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl Rahim boynu numunesinden DNA ekstraktı (DNA şablonu) 5 µl Reaksiyon başına toplam hacim 26 µl 24 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 8.3 Hibridizasyon ve yıkama 8.3.1 Hazırlama ve kurulum Hibridizasyon oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir (20-25 °C). Hibridizasyon ve yıkama adımlarının gerekli hazırlıklarına hibridizasyon prosedürünü başlatmadan en az 30 dakika önce başlayın. ➠➠ Hibridizasyon ve yıkama tamponlarında potansiyel çökeltileri çözmek için bunları 30 dakika süreyle oda sıcaklığına (20-25 °C) maruz bırakın ve kullanım öncesinde iyice karıştırın. PapilloCheck® high-risk test kitinin 4-8 °C'de saklanması Hibridizasyon Tamponunda ve Tampon B'de SDS çökeltisi ile sonuçlanabilir. Solüsyonların oda sıcaklığına dengelenmesini bekleyin ve daha sonra tüpe vorteks uygulayın veya çökeltiler çözülene kadar şişeyi karıştırın. ➠➠ oCheck® Hibridizasyon Odasını Hazırlayın: Hibridizasyon Odasına yeni bir nemli kağıt havlu yerleştirin ve neme doygun bir ortam oluşturmak için kapağı kapatın. Çip üzerindeki kullanılmış hibridizasyon karışımının küçük hacminin buharlaşmasını önlemek için hibridizasyonun neme doygun bir ortamda gerçekleştirilmesi gerekir. Greiner Bio-One tarafından PapilloCheck® high-risk analizi için özel bir Hibridizasyon Odası sunulmaktadır (bkz. Bölüm 2). ➠➠ Gereken miktarda PapilloCheck® high-risk çiplerini hazırlanan Hibridizasyon Odasında en az 10 dakika süreyle oda sıcaklığında (20-25 °C) inkübe edin. ! Hibridizasyon Odasının manyetik slide tutucusu iki ucun yalnızca birinde bir mıknatıs içerir. Dörtten az PapilloCheck® high-risk çipinin paralel olarak hibridize edilmesinin gerekmesi durumunda slide tutucuyu mıknatısın karşı tarafından PapilloCheck® high-risk çipleri ile doldurmaya dikkat edin. Aksi takdirde PapilloCheck® high-risk çipleri yıkama prosedürü sırasında sıvı ile kaplanmaz. ➠➠ Yıkama solüsyonları I, II ve III'ü aşağıdaki talimatlara uygun olarak hazırlayın. Yıkama solüsyonları I, II ve III'ün hazırlanması: ➠➠ Yıkama solüsyonu karışımını Tablo 4'te gösterildiği gibi analiz edilmekte olan PapilloCheck® high-risk çipleri sayısı için uygun olan yıkama solüsyonları I, II ve III için hazırlayın. ➠➠ Yıkama solüsyonu karışımının üç eşit hacmini üç ayrı oCheck® Yıkama Teknelerine alikuotlar halinde bölün ve yıkama solüsyonu I, II ve III olarak etiketleyin. Her bir oCheck® Yıkama Teknesi, 4 çipe kadar gerekli olan yıkama solüsyonunun doğru miktarını gösteren yerleşik bir terazi içermektedir. Tampon miktarını kontrol etmek için lütfen bu teraziyi kullanın. ➠➠ Yıkama solüsyonu II'yi kullanmadan önce sıcaklık kontrollü bir su banyosunda en az 20 dakika süreyle 50 °C'ye önceden ısıtın. Su banyosunun dolum seviyesinin yıkama solüsyonu II'nin dolum seviyesine eşit olmasını sağlayın. 25 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 Tablo 4: Yıkama solüsyonu karışımının hazırlanması Bu tabloda özetlenen hacimler belirtilen sayıdaki PapilloCheck® high-risk çipleri için üç yıkama adımı (yıkama çözücüleri I, II ve III) için de yeterlidir. PapilloCheck® high-risk çiplerinin sayısı Bileşenler 1 2 3 4 Distile veya deiyonize su 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml PapilloCheck® high-risk Tampon A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml PapilloCheck® high-risk Tampon B 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml Toplam hacim ! Muhtemelen PapilloCheck® high-risk sonuçlarına engel olacak yıkanmış PCR ürünlerinin birikmesine yol açacağından yıkama solüsyonlarını kesinlikle yeniden kullanmayın. Her miktar tayini için yeni yıkama solüsyonu kullanın. Hazırlanan yıkama solüsyonu karışımı oda sıcaklığında bir hafta süreyle saklanabilir. SDS çökeltisi meydana gelip gelmediğini kontrol edin. Çökelti meydana gelmişse, çökelti çözülene kadar yıkama solüsyonu karışımını ısıtın ve tekrar oda sıcaklığına dengeleyin. Daha sonra bir sonraki hibridizasyon deneyi için hazırlanın. 26 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 8.3.2 Hibridizasyon Hibridizasyon oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir (20-25 °C). PapilloCheck® high-risk PCR reaksiyonunun PCR ürünlerini PapilloCheck® high-risk çipine hibridize etmeye yönelik başlıca çalışma adımları Şekil 5'te gösterilmektedir. ➠➠ PCR ürünlerini kullanmadan önce karıştırın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün. PCR ürünleri hibridizasyona kadar -20 °C'de saklanmışsa PCR ürünlerini karıştırmadan önce çözün ve daha sonra belirtilen şekilde ilerleyin. ➠➠ Hibridizasyon Tamponuna kullanmadan önce vorteks uygulayın. Kısa süreliğine aşağı doğru bükün. ➠➠ 30 µl PapilloCheck® high-risk Hibridizasyon Tamponunu 8x PCR şeridin yeni reaksiyon tüpünde 5 µl PCR ürünü ile vorteks uygulayarak veya birkaç kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyerek karıştırın. ➠➠ Kısa süreliğine aşağı doğru bükün. ➠➠ 25 µl hibridizasyon karışımını, çok kanallı bir pipetin altı kanalını kullanarak her bir çip kuyucuğuna aktarın. Hava kabarcığı oluşmasını önleyin! 8 kanallı multipipet ve 8x PCR şeridi kullanılarak altı numunenin paralel bir şekilde işlenmesi önerilir (bkz. Şekil 5). Bu kullanım etkinliğini, hızını arttırır ve böylece buharlaşma riskini azaltır. Bir seferde birden fazla slaytın işlenmesi gerekiyorsa multipipet kullanımı, doğru hibridizasyon süresinin elde edilmesi için zorunludur. Mümkün olursa bir çipin 12 kuyucuğunu hibridize edin. 12'den daha az numunenin işlenmesi durumunda kullanılmamış kuyucukları boş bırakın. İşlenmiş bir çipte kullanılmamış kuyucuklar gelecek numuneler için kullanılamaz. ! Hibridizasyon karışımının dökülmesini önlemek için çipi dikkatli bir şekilde kullanın. Dökülme numunelerin çapraz kontaminasyonuna ve hatalı pozitif sonuçlara neden olabilir. Çipi, karanlık, neme doygun bir ortamda, hazırlanmış bir Hibridizasyon Odası içinde oda sıcaklığında (20-25 °C) tam olarak 15 dakika süreyle inkübe edin. Hibridizasyon sırasında Hibridizasyon Odasını hareket ettirmemeye dikkat edin. ! İnkübasyon zamanını veya hibridizasyon reaksiyonunun sıcaklığını kesinlikle değiştirmeyin, bu floresan sinyal yoğunluğunun kaybolmasına veya spesifik olmayan floresanda artışa neden olabilir. Hibridize edilen çipleri doğrudan güneş ışığına maruz bırakmayın. 27 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 ➠➠ ➠➠ Hibridizasyon Odasında neme doygun bir ortam hazırlayın. Gereken miktarda PapilloCheck® high-risk çiplerini hazırlanan Hibridizasyon Odasında oda sıcaklığında (20-25 °C) inkübe edin (bkz. Bölüm 8.3.1). ➠➠ 30 µl PapilloCheck® high-risk Hibridizasyon Tamponunu PCR şeridin 0.2 ml reaksiyon tüpünde 5 µl PCR ürünü ile inkübe edin. İyice karıştırın. ➠➠ 25 µl hibridizasyon karışımını PapilloCheck® high-risk çipinin her bir kuyucuğuna çok kanallı bir pipet kullanarak aktarın ➠➠ Hibridizasyon Odasını kapatın ve PapilloCheck® high-risk çipini tam olarak 15 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin (20-25 °C). Şekil 5: Hibridizasyon prosedürünün çalışma adımları 28 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 8.3.3 Yıkama ve kurutma Greiner Bio-One tarafından tedarik edilen özel ekipman dört PapilloCheck® high-risk çipinin paralel yıkanmasını sağlar (bkz. Bölüm 2). PapilloCheck® high-risk çiplerinin işlenmesi için gerekli olan ek ekipmanlar üç adet oCheck® Yıkama Teknesi ve Hibridizasyon Odasının manyetik slide tutucusu kolundan oluşmaktadır. Farklı çalışma adımları Şekil 6'da gösterilmektedir. ➠➠ Hibridize edilen slaytları içeren manyetik slide tutucuyu Hibridizasyon Odasından dikkatli bir şekilde çıkarın. ➠➠ Slide'ları içeren slide tutucuyu doğrudan yıkama solüsyonu I'i içeren oCheck® Yıkama Teknesine bırakın. Manyetik tarafın ön tarafa baktığından emin olun. ➠➠ oCheck® Kolunu slide tutucusuna takın ve üç yıkama adımının ilkine başlayın. ➠➠ Çipi oda sıcaklığında (20-25 °C) yıkama solüsyonu I içinde 10 saniye süreyle hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı hareket ettirerek yıkayın. Diziler daima yıkama solüsyonu ile kaplı bir şekilde kalmalıdır. ➠➠ Çipi yıkama solüsyonu II içinde 60 saniye süreyle 50 °C'de slide tutucuyu yukarı kuvvetlice hareket ettirerek yıkayın. ➠➠ Çipi oda sıcaklığında (20-25 °C) yıkama solüsyonu III içinde 10 saniye süreyle hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı hareket ettirerek yıkayın. ➠➠ Santrifüj ile, çip yüzeyinden tüm sıvıları hemen giderin. Mikrodiziler için özel bir mikrosantrifüj kullanılırsa 1 dakika süreyle santrifüj edin. 50 ml'lik tüpler için geçerli olan bir santrifüjün kullanılması durumunda her yıkanan PapilloCheck® high-risk çipini 50 ml'lik bir tüpe yerleştirin ve oda sıcaklığında 3 dakika süreyle 500 g'de santrifüj edin. PapilloCheck® high-risk çipi artık tarama için hazırdır ve hemen taranmalıdır. oCheck® Yıkama Teknelerinin temizlenmesi için tamamlanan her yıkama ve kurutma işleminden sonra birkaç durulayın. 29 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 Birinci yıkama adımı ➠➠ ➠➠ ➠➠ ➠➠ Manyetik slide tutucuyu Hibridizasyon Odasından dikkatli bir şekilde çıkartın. Slide tutucuyu oCheck® Yıkama Teknesine yıkama solüsyonu I ile hızlı bir şekilde bırakın oCheck® Kolunu takın PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) yıkama solüsyonu I'de oda sıcaklığındaslide tutucuyu yukarı ve aşağı hareket ettirerek 10 saniye süresince yıkayın İkinci yıkama adımı ➠➠ PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) yıkama solüsyonu II'de bir su banyosunda 50 °Csıcaklıkta slide tutucuyu yukarı ve aşağı hareket ettirerek 60 saniye süresince yıkayın Üçüncü yıkama adımı ➠➠ PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) yıkama solüsyonu III'te oda sıcaklığında slide tutucuyu yukarı ve aşağı hareket ettirerek 10 saniye süresince yıkayın veya Kurutma ➠➠ PapilloCheck® high-risk çiplerinin yüzeyindeki tüm sıvıları santrifüj ile hemen giderin 3 dakika 500 g 1 tabi tutun maks. hız Şekil 6: Yıkama prosedürünün çalışma adımları PapilloCheck® high-risk çipinin CheckScannerTM ve the CheckReportTM Yazılımı ile analizinden önce farklı yıkama prosedürleri ve kurutma prosedürü. 30 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 8.4 PapilloCheck® high-risk çipinin taraması ve değerlendirmesi PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) CheckScannerTM'e yerleştirin ve CheckReportTMYazılımının Kullanıcı Kılavuzunda tanımlandığı gibi taramaya devam edin. CheckScannerTM ve CheckReportTMYazılımının kurulumu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi ve bilgisayar sistem gereksinimleri için lütfen CheckScannerTM ve CheckReportTMYazılımının Kullanım Kılavuzuna başvurun. CheckReportTMYazılımını kullanarak verileri analiz ederken bilgisayarınızda kurulu olan CheckReportTMYazılımı versiyonunun, halihazırda kullanılan PapilloCheck® high-risk kitinde belirtilen versiyonla eşleştiğinden emin olun. Versiyonlar eşleşmiyorsa CheckReportTMYazılımını güncelleyin. Son Yazılımın versiyonu Greiner Bio-One internet sitesinden indirilebilir: www.gbo.com/bioscience/biochips_download 31 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 9. sorUN giDerMe Çip taraması sırasında aşağıdaki hata mesajlarından birinin oluşması veya PapilloCheck® high-risk analizinin spesifik çip üstü kontrollerine bağlı olarak başarısız olması durumunda aşağıda belirtildiği şekilde ilerleyin. PapilloCheck® high-risk ürününü kullanırken herhangi bir sorunuz olması veya herhangi bir güçlükle karşılaşmanız durumunda lütfen yerel Greiner Bio-One distribütörünüz ile hr-HPV DNA-Chip iletişime geçin. sorUN ve sebebi Açıklamalar ve öneriler hATA MesAJI,,BArkoD okUNAMADI“ hasarlı barkod Barkodu hasar açısından kontrol edin. Uygun pencere görüldüğünde barkodu manüel olarak girin. Çip doğru bir şekilde yüklenmedi Çip oryantasyonunu kontrol edin ve çipi doğru oryantasyonda tarayın. 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir hATA MesAJI „eksik NokTALAr“, BAskI koNTroLÜ BAŞArIsIZ oLDU VeYA orYANTAsYoN koNTroLÜ BAŞArIsIZ oLDU Çip üzerinde toz PCR ürününün (ürünlerinin) hibridizasyonunu başka bir çip üzerinde tekrar edin. Çip üzerine sıvı transferi sırasında hava kabarcıkları oluşumu PCR ürününün (ürünlerinin) hibridizasyonunu başka bir çip üzerinde tekrar edin. Hava kabarcığı oluşumunu engellemek için dikkatli bir şekilde pipetleyin. hiBriDiZAsYoN koNTroLÜ BAŞArIsIZ oLDU hatalı yıkama solüsyonu II sıcaklığı ikinci yıkama adımı 50 °C'de gerçekleştirilmelidir. Yıkama solüsyonu II'nin 50 °C'ye ısıtılmasını sağlayın. hatalı su banyosu sıcaklığı ikinci yıkama adımı 50 °C'de gerçekleştirilmelidir. Su banyosunun sıcaklığını kontrol edin. Su banyosunun 50 °C sıcaklığa ayarlanmasını sağlayın. Gerekirse, bir termometre kullanarak sıcaklığı onaylayın. PapilloCheck® high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız hibridizasyon karışımının hatalı hazırlanması Hibridizasyon karışımının hazırlanmasını tekrar edin ve PCR ürünlerini başka çip üzerinde hibridize edin. servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 32 sorUN ve sebebi Açıklamalar ve öneriler 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir PCr koNTroLÜ BAŞArIsIZ hotstarTaq® DNA Polimerazı MasterMix'e eklenmedi PapilloCheck® high-risk analizini, PCR reaksiyonunun hazırlanması ile başlayarak tekrar edin. Uygun işlemeyen hotstarTaq® DNA Polimerazının MasterMix'e eklenmesi PapilloCheck® high-risk analizini, PCR reaksiyonunun hazırlanması ile başlayarak tekrar edin. seyreltilmemiş Urasil-N-glikosilaz'ın MasterMix'e eklenmesi PapilloCheck® high-risk analizini, PCR reaksiyonunun hazırlanması ile başlayarak tekrar edin. reaksiyon karışımının yetersiz karışımı PapilloCheck® high-risk analizini, PCR reaksiyonu ile başlayarak tekrar edin. Reaksiyon karışımını iyice karıştırmaya dikkat edin. PCr inhibitörleri numune mevcuttur DNA izolasyonunu ve PapilloCheck® high-risk analizini tekrar edin. hibridizasyon, PCr ürünü eklenmeden gerçekleştirilmiştir Hibridizasyonu tekrar edin. hibridizasyon karışımının yetersiz karışımı Hibridizasyonu tekrar edin. Termal döngüleyicide sorunlar Termal döngüleyicinin performansını ve termal döngüleyicinin doğru programlanıp programlanmadığını kontrol edin (PCR adımları, ısı rampası, hacim). Dikkat: Termal döngüleyici GeneAmp® PCR Sistemi 9700 (Uygulamalı Biyosistemler) veya Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyiciyi hr-HPV DNA-Chip (Uygulamalı Biyosistemler) PapilloCheck® high-risk ile kullanın. NUMUNe koNTroLÜ BAŞArIsIZ oLDU PapilloCheck high-risk Numune DNA'sı PCr reaksiyonuna eklenmedi ® PapilloCheck® high-risk analizini PCR reaksiyonu ile başlayarak tekrar edin. DNA hazırlama başarısız oldu DNA izolasyonunu tekrar edin. Yeterli numune materyali yok Başarısız numune toplama. Örnek çok açık. Örneği Bölüm 9.1'deki açıklamaya uygun olarak konsantre edin ve DNA izolasyonunu veya numune toplamayı tekrar edin. kullanım kılavuzuna Bakınız PCr Ve/VeYA NUMUNe koNTroLLeri BAŞArIsIZ oLMADI ANCAk 0 sNr DeĞeri gÖrÜNTÜLeNiYor Bu sonuç, CheckReportTMYazılımının numunede tanımlanmış eşiğin üzerinde sinyali olan en az bir HPV türünü tespit etmesi durumunda geçerli olarak değerlendirilir. Numune ve/veya PCR kontrolü, PCR sırasındaki rekabet nedeniyle daha sonra floresan sinyallerinin düşük olduğunu veya olmadığını gösterebilir. servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti 10. TekNik YArDIM Xn reF 505 060 Greiner Bio-One, moleküler biyoloji ve oCheck® ürünlerinde kapsamlı uygulama ve teori deneyimi Yalnızca laboratuar personeli tarafından edinmiş uzman profesyonel bilim adamlarından oluşan bir Teknik Servis Departmanına sahiptir.revizyon: oCheck® BQ-065-01 in-vitro tanılarda kullanılması ürünleriyle ilgili herhangi bir sorunuziçindir veya sorununuz olduğunda, lütfen yerel Greiner Ağustos Bio-One 2011 distribütörünüze başvurmaktan çekinmeyin. greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 33 11. PAPilloCheCk® hIgh-rIsk PerForMANs ÖZeLLikLeri PapilloCheck® high-risk (Cat. No. 505 060) 14 yüksek riskli HPV türünün genotiplenmesinde kullanılan mikrodizi tabanlı bir tanı kitidir. Greiner Bio-One PapilloCheck® (Cat. No. 465 060) tarafından kullanılan aynı teknoloji ve kilit bileşenlerden faydalanır ve PapilloCheck® high-risk tarafından tespit edilebilen 14 yüksek riskli HPV tipi de dahil olmak üzere 24 HPV tipinin genotiplemesinde kullanılan hr-HPV DNA-Chip bir tanı kitidir. PapilloCheck® ile karşılaştırıldığında, PapilloCheck® high-risk test kiti, indirgenmiş düzene sahip bir mikrodizi slide kullanır. PapilloCheck® high-risk çip yüzeyine damlatılan prob seti, PapilloCheck® prob setinin bir alt setidir. 11.1 PapilloCheck® high-risk'in analitik performansı 11.1.1 Analitik hassasiyet Belirleme sınırı (lOD) PapilloCheck® high-risk tarafından hedef alınan E1 bölgesini içeren her tespit edilebilir HPV türü için referans plazmidleri kullanılarak belirlenmiştir. lOD'lar Tablo 8'de özetlenmektedir. 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir Tablo 8: Tespit edilebilir hPV türlerinin belirleme sınırları hPV genotipi kopyalar / reaksiyon pg/ml** hPV 16 50* 0.086 hPV 18 300* 0.516 hPV 31 300* 0.522 hPV 33 300* 0.519 PapilloCheck high-risk hPV 35 750* hPV 39 30* 0.052 hPV 45 50* 0.087 hPV 51 30* 0.051 hPV 52 100* 0.174 hPV 56 30* 0.052 hPV 58 150* 0.255 hPV 59 50* 0.087 hPV 66 100* 0.171 ® 1.29 kullanım kılavuzuna Bakınız servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan 30* 0.052 papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn hPV 68 * Her bir HPV referans plazmidinin valide edilen konsantrasyonu 2 bağımsız seyreltme serisinde hazırlanmıştır ve test 505 060 3 tekrarında ölçülmüştür (örn: konsantrasyon başına toplam 6 tekrar). Ayrıca her test 10 ng edilenreF konsantrasyonun insan DNA'sı içermekteydi. Valide edilmiş verilerde bir değişiklik olması durumunda belirli plazmidin konsantrasyonları arttırılmış veya azaltılmıştır ve tekrar test edilmiştir (2 bağımsız seyreltme serisinden 6 tekrar). Tespit sınırı 6 tekrarın Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından revizyon: BQ-065-01 pozitif olduğu durumda en düşük konsantrasyondu. kullanılması ** DNA in-vitro hazırlamatanılarda dikkate alınmadan doğrudaniçindir analiz edilmiştir. Miktar plazmidde bulunan HPV-DNA ile ilgilidir.Ağustos 2011 greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 34 11.1.2 Analitik özgüllük – hPV türleri listelenen HPV türlerinin referans plazmidleri 2,12 x 106 kopya/PCR reaksiyonu ile test edilmiştir. HPV 6b, HPV 11, HPV 13, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 30, HPV 31, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 55, r - H P71, V DN A - C h73, ip HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 66, HPV 67, HPV 68, HPV 69, HPV 70, hHPV HPV HPV 74, HPV 81, HPV 82, HPV 84, HPV 85, HPV 91. Çapraz hibridizasyon tespit edilmedi 11.1.3 Analitik özgüllük – hPV dışı organizmalar 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir Aşağıdaki HPV dışı organizmalar PapilloCheck® high-risk ile test edilmiştir (5-10 ng genomik DNA). Pozitif sinyal tespit edilmemiştir. Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffii, Actinobacillus actinomycetemcomitans Serovar c, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces viscosus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve, Campylobacter concisus, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Candida albicans, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter koseri, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Eikenella corrodens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterococcus durans, Enterococcus faecali, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium nodatum , Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis, Hafnia alvei, Kingella denitrificans, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners, Lactobacillus rhamnosus,Lactobacillus vaginalis, Mogibacterium timidum, Morganella morganii, Mycoplama hominis, Mycoplasma buccale, Mycoplasma faucium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma orale, Mycoplasma pirum, Mycoplasma salivrium, Mycoplosma pneumoniae, Neisseria elongata, Neisseria gonorrhoeae, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Proteus hauseri, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus ssp. aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus ®Streptococcus agalactiae, Streptococcus constellatus, Streptococcus criceti, saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus cristatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Tannerella forsythensis (önceki: Bacteroides forsythus), Treponema denticola, Ureaplasma uralyticum, Veillonella parvula. PapilloCheck high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 35 11.2 Tekrarlanabilirlik Test tekrarlanabilirliğinin değerlendirilmesi için her biri üç farklı HPV referans şablonunun yanı sıra insan genomik DNA'sı içeren beş numune PapilloCheck® high-risk ile analiz edilmiştir. Numunelerde bulunan farklı HPV hedeflerinin kopya numaralarının yanı sıra insan DNA arka planı değiştirilmiştir (bkz. Tablo 9). PapilloCheck® high-risk ile beş bağımsız kopyada her numune analiz edilmiştir. hr-HPV DNA-Chip Kopyalar, üç gün içinde aynı teknisyen tarafından test edilmiştir. 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir Tablo 9: Numunelerin tekrarlanabilirlik testleri için bileşimi Numune kimliği hPV türü Şablon DNA miktarı numune 1 HPV 16 HPV 18 HPV 31 insan genomik DNA'sı 180 kopya 1.500 kopya 1.400 kopya 1 ng 3 10 30 numune 2 HPV 16 HPV 18 HPV 31 insan genomik DNA'sı 180 kopya 1.500 kopya 1.400 kopya 5 ng 3 10 30 numune 3 HPV 16 HPV 18 HPV 45 insan genomik DNA'sı 1.800 kopya 450 kopya 300 kopya 5 ng 30 3 10 numune 4 HPV 16 HPV 18 HPV 45 insan genomik DNA'sı 10.000 kopya 5.000 kopya 20.000 kopya 2,5 ng - HPV 18 HPV 31 HPV 45 insan genomik DNA'sı 4.500 kopya 500 kopya 90 kopya 2,5 ng 30 10 3 PapilloCheck® high-risk numune 5 kullanım kılavuzuna Bakınız x-kat tespit sınırı Beş numune ve tekrarlanan her analiz için doğru üç HPV türü tespit edilmiştir ve analiz dahil edilmeyen tür için negatif çıkmıştır. Böylece 75 tek test sonucunun 75'i (5 numune x 5 kopya x kullanılan 4 farklı HPV şablonu) doğru çıkmıştır. servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 36 11.3 Yeniden Üretilebilirlik PapilloCheck® high-risk test kitinin yeniden üretilebilirliği, HPV konsantrasyonları belirleme sınırına takın 22 klinik numune (bkz. Tablo 10) kullanılarak tespit edilmiştir. Saptama, aynı numune materyali ile, farklı personel tarafından ve farklı laboratuvarlarda farklı aletler ile aynı yöntem kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tek veya çift enfeksiyonlarda aynı HPV türleri tespit edilmiş ise veya sırasıyla hr-HPV DNA-Chip üç veya dört türünde çoklu enfeksiyon halinde iki veya üç aynı HPV türleri tespit edilmişse sonuçlar pozitif numuneler açısından uyumlu olarak değerlendirilmiştir. 4° 8° IVD Avusturya'da üretilmiştir Tablo 10: Yeniden üretilebilirlik testlerinin sonuçları Numune No. sonuç Laboratuvar 1 sonuç Laboratuvar 2 Uyum 1 HPV 33 HPV 33 + 2 HPV 35 HPV 35 + 3 negatif negatif + 4 HPV 45 HPV 45 + 5 HPV 51, HPV 52 HPV 51, HPV 52 + 6 HPV 51, HPV 56 HPV 51, HPV 56 + 7 HPV 16, HPV 39, HPV 68 HPV 16, HPV 39, HPV 68 + 8 HPV 39, HPV 68 HPV 39, HPV 68 + 9 HPV 16 HPV 16 + 10 negatif negatif + PapilloCheck® high-risk 11 HPV 56 HPV 56, + 12 negatif negatif + 13 HPV 18, HPV 56 HPV 18, HPV 56 + 14 HPV 51 HPV 51 + 15 HPV 58 HPV 58, HPV 68 + 16 negatif negatif + 17 HPV 16 HPV 16 + 18 HPV 16 HPV 16 + 19 HPV 45 HPV 45 + 21 HPV 58 HPV 58 + 22 HPV31 HPV 31 + kullanım kılavuzuna Bakınız servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan 20 HPV 16 + papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanıHPV kiti16 Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından revizyon: BQ-065-01 Tüm klinik numuneler için uyumlu sonuçlar elde edilmiştir. Çoklu enfekte numune 15'te (HPV 68) 2011 in-vitro tanılarda kullanılması içindir Ağustos laboratuvar 2 tarafından tespit edilen ek tür sinyalleri tanımlanan eşiğin biraz üzerinde olduğundan, uyumsuz sonuç sorunsuz olarak sınıflandırılmıştır. greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 37 11.4 Dayanıklılık PapilloCheck® high-risk test sisteminin dayanıklılığını değerlendirmek için aşağıdaki parametrelerin sistem değişiklikleri değerlendirilmiştir: • Hibridizasyon sıcaklığı hr-HPV DNA-Chip • Hibridizasyon süresi • Yıkama sıcaklığı • Yıkama süresi Tüm testler yüksek şablon konsantrasyonları ile 3 kez gerçekleştirilmiştir (1 ng HPV referans plazmid veya numune başına yaklaşık 200 x 106 kopya). Parametre değerlerinin dayanıklı HPV tespitinin mümkün olduğu aralıkları Tablo 11'de özetlenmiştir. Tablo 11: PapilloCheck® high-risk Dayanıklılığı Parametre Aralık IVD Avusturya'da üretilmiştir hibridizasyon sıcaklığı hibridizasyon süresi 20-25 ºC'de inkübe edilmesiyle 13-17 dakikadan 48-52 °C'de inkübe edilmesiyle Yıkama sıcaklığı 1. yıkama adımı 10-15 saniye PapilloCheck® high-risk 2. yıkama adımı 60-75 saniye Yıkama süresi kullanım kılavuzuna Bakınız 4° 8° 3. yıkama adımı 10-15 saniye servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti Xn reF 505 060 Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir greiner Bio-one gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • Almanya Tel: +49 (0) 7022 948-0 • Faks +49 (0) 7022 948-514 info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 38 PapilloCheck® high-risk'in klinik Performansı 11.5 Greiner Bio-One PapilloCheck® miktar tayininin klinik hassasiyet ve özgüllük açısından klinik performansını belirlemek için PapilloCheck® ve GP5+/6+-PCR EIA miktar tayini kullanılarak bir karşılaştırma çalışması gerçekleştirilmiştir.7 Bu çalışma için normal sitolojili 40 yaş üzeri 1.437 kadından (ortalama yaş, 49 yaş, yaş aralığı 40 ila 60) ve histolojik olarak onaylanmış CIN3+ r-HPV DNA-Chip lezyonlarına sahip (vaka grubu) 192 kadından (ortalama yaş, 34 yaş; yaş aralığı , 30hila 60) numuneler analiz edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm numuneler POBASCAM popülasyon tabanlı randomize kontrollü uygulama çalışmasının müdahale grubundaki kadınlardan başlangıç turu sırasında orijinal olarak toplanmıştır.8 PapilloCheck® analizi GP5+/6+-PCR-EIA ve yeni PapilloCheck® high-risk ile hedeflenen 14 hrHPV türü ile sınırlandıktan sonra, PapilloCheck® %95,8 ≥ CIN3 klinik hassasiyete (184/192; %95 CI 92,8-98,8) ve %96,7 ≥ CIN2 klinik özgüllüğe (%95 CI 95,7-97,7) sahip olmuştur. Bu rakamların karşılaştırıldığında sırasıyla % 96,4 (185/192; % 95 CI: 93,9-98,9) ve % 97,7 (% 95 CI: 96,9-98,5) olduğu görülmüştür, GP5+6+-PCR-EIA için (bkz. Tablo 5 ve 6). Tablo 5: PapilloCheck® (PapilloCheck® high-risk tarafından hedeflenen 14 hrhPV türü) ve gP5+/6+ PCreIA sonuçlarının karşılaştırılması kontroller ve vakalar için örneklendirilmiştir. Avusturya'da üretilmiştir PapilloCheck® (14 hr hPV türü) 4° 8° IVD kontroller Vakalar gP5+/6+-PCr/eIA - Toplam + - + toplam 1.386 (% 96,5) 4 (% 0,3) 1.390 (% 96,7) 18 (% 1,3) 29 (% 2,0) 1.404 (% 97,7) 36 (% 2,3) 47 (% 3,3) 1.437 + ® toplam 4 (% 2,1) 4 (% 2,1) 8 (% 4,2) 3 (% 1,6) 181 (% 94,3) 7 (%3,6) 185 (% 96,4) 184 (% 95,8) 192 PapilloCheck high-risk kullanım kılavuzuna Bakınız Tablo 6: PapilloCheck® klinik hassasiyeti ve özgüllüğü ve gP5+/6+-PCr-eIA (14 hr hPV türünden birinin veya daha fazlasının hPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 veya 68 sonuçları). 14 hrhPV PapilloCheck® gP5+/6+ ≥ CIN3 için klinik hassasiyet % 95,8 % 96,4 ≥ CIN2 için klinik Özgüllük % 96,7 % 97,7 servikal numunelerde 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 insan papillomavirüs tiplerinin genotiplemesine yönelik tanı kiti reF 505 060 Xn Yalnızca profesyonel laboratuar personeli tarafından in-vitro tanılarda kullanılması içindir 7 8 revizyon: BQ-065-01 Ağustos 2011 Comparison of the clinical performance of PapilloCheck® human papillomavirus detection with that of the GP5+/6+PCR-enzyme immunoassay in population-based cervical screening. Hesselink AT, Heideman DA, Berkhof J, Topal F, Pol RP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol. 2010 Mar;48(3):797-801. Epub 2009 Dec 30. Bulkmans, N. W., l. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, A. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R. greinerM. Bio-one H. Verheijen, K. Groningen, E. Boon,gmbh H. J. Keuning, M. van Ballegooijen, A. J. van den Brule, and C. J. Meijer. 2004. Maybachstr. 2randomized • 72636 Frickenhausen Almanya POBASCAM, a population-based controlled trial• for implementation of high-risk HPV testing in cervical Tel: +49 and (0) 7022 948-0 +49women. (0) 7022 screening: design, methods baseline data•ofFaks 44,102 Int. 948-514 J. Cancer 110:94–101. info@de.gbo.com • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 39 12. PapilloCheck® high-risk KISA PROTOKOL 12.1 Oda 2: PCR - Reaksiyon karışımının kurulumu ➠➠ ➠➠ PCR kalitesinde suda Urasil-N-Glikosilaz'ı 1:200 oranında seyreltin ➠➠ PCR reaksiyonlarının gereken miktarı için reaksiyon karışımını hazırlayın PCR Oda 2 K I O R T UNG seyreltmesini dikkatli bir şekilde karıştırın 1 13 reaksiyon reaksiyon (1 çip) 26 reactions (2 çip) 39 reactions (3 çip) 52 reactions (4 çip) PapilloCheck® high-risk PCR MasterMix 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl HotStar Taq® Polimeraz (5 U/µl) 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl Urasil-NGlikosilaz (1:200 seyreltme, 0,005 U/µl) 1 µl 13µl 26 µl 39 µl 52 µl Numune DNA eklenmeden önce toplam hacim 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl ➠➠ Reaksiyon karışımını dikkatli bir şekilde karıştırın ➠➠ Reaksiyon karışımını alikuotlara bölün: her PCR reaksiyonu için 21 µl reaksiyon karışımı PCR şeridinin 0,2 ml PCR reaksiyon tüpüne ekleyin P R O T O K O L 40 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 PCR 12.2 Oda 2: PCR - DNA şablonu ekleme / PCR reaksiyonu Oda 2 ➠➠ ➠➠ Her PCR reaksiyonu için5 µl DNA şablonunu ekleyin ➠➠ PCR reaksiyonunu hazırlanana termal döngüleyici programı ile başlatın K I O R T İyice karıştırın Süre Sıcaklık °C Döngü sayısı 20 dk. 37 °C 1 15 dk. 95 °C 1 30 sn. 25 sn. 45 sn. 95 °C 55 °C 72 °C 40 30 sn. 45 sn. 95 °C 72 °C 15 Tutun 10 °C P R O T O K O L 41 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 Hibridizasyon ve Yıkama 12.3 Oda 3: Hibridizasyon - Hazırlama / Hibridizasyon reaksiyonu ! ➠➠ ➠➠ Oda 3 Hibridizasyondan en az 30 dakika önce hazırlıklara başlayın. K I O R T Hibridizasyon ve yıkama tamponlarında potansiyel çökeltileri çözün ve iyice karıştırın Analiz edilecek PapilloCheck® high-risk çipi miktarı için yıkama solüsyonu hazırlayın. PapilloCheck® high-risk çiplerinin sayısı Bileşenler 1 2 3 4 Distile/deiyonize su 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml PapilloCheck® high-risk Tampon A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml PapilloCheck® high-risk Tampon B 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml Toplam hacim ➠➠ ➠➠ Yıkama solüsyonu karışımını üç oCheck® Yıkama Teknesine alikuotlara bölün ➠➠ Analiz edilecek PapilloCheck® high-risk çiplerini oda sıcaklığında hazırlanan Hibridizasyon Odasında inkübe edin Yıkama solüsyonu II'yi 50 °C'deki su banyosunda önceden ısıtın ➠➠ ➠➠ ➠➠ PCR ürünlerini karıştırın ve kısa süreliğine aşağı doğru bükün ➠➠ İyice karıştırın ve kısa süreliğine aşağı doğru bükün ➠➠ ➠➠ ➠➠ P R O T O K O L Hibridizasyon Tamponunu karıştırın ve kısa süreliğine aşağı doğru bükün 30 µl PapilloCheck® high-risk Hibridizasyon Tamponunu 5 µl PCR ürünü ile karıştırın 25 µl hibridizasyon karışımını PapilloCheck® high-risk çipinin her bir kuyucuğuna çok kanallı bir pipet kullanarak aktarın Hava kabarcığı oluşmasını önleyin PapilloCheck® high-risk çipini tam olarak 15 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin (20-25 °C) 42 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011 Hibridizasyon ve Yıkama 12.4 Oda 3: Yıkama ve kurutma / Tarama ve değerlendirme ➠➠ ➠➠ ➠➠ ➠➠ K I O R T Manyetik slide tutucuyu Hibridizasyon Odasından çıkarın Slide tutucuyu oCheck® Yıkama Teknesine yıkama solüsyonu I ile bırakın oCheck® Kolunu takın PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) yıkama solüsyonu I'de oda sıcaklığında 10 saniye süreliğine yıkayın ➠➠ PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) önceden ısıtılmış yıkama solüsyonu II'de su banyosunda 50 °C'de 60 saniye süresince yıkayın ➠➠ PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) yıkama solüsyonu III'de oda sıcaklığında 10 saniye süreliğine yıkayın ➠➠ Oda 3 P R O T O K O L PapilloCheck® high-risk çip yüzeyindeki tüm sıvıları santrifüj ile giderin 3 dakika veya 1 tabi tutun 500 g maks. hız ➠➠ ➠➠ ➠➠ PapilloCheck® high-risk çipini (çiplerini) with the CheckScannerTM ile tarayın Tarama ve analizi CheckReportTMYazılımı Kullanıcı Kılavuzunda belirtildiği gibi gerçekleştirin Rapor oluşturun 43 PapilloCheck® high-risk - Kullanım Kılavuzu Revizyon: BQ-065-01 / Ağustos 2011