yayını indir [pdf dosyası]
Transkript
yayını indir [pdf dosyası]
KIKIRDAK DOKU REJEERASYO SĐSTEMĐ (CaReS®) KODROSĐT-KOLLAJE MS® BĐYOUYUMLULUK Cartilage Regeneration System (CaReS®) Chondrocyte-Collagen MS® Biocompatibility Çiğdem Kalın1, Selin Akpınar1, Sezen Bolat1, Z. Sera Konur1, H.Şebnem Küçük1 E-Posta: cigdem@arsarthro.com.tr 1 Ars Arthro Biyoteknoloji A.Ş., Bilkent Cyberplaza B Blok No:702 06800 Bilkent,Ankara,Türkiye I. GĐRĐŞ Özetçe: CaReS® hiyalin kıkardağın rejenerasyon sürecini hızlandıran ve optimize eden patentli 3D Kollajen Tip I matriksine dayanan yenilikçi bir transplantasyon teknolojisidir. Bu çalışmada 30 hasta üzerinde kolajen fenotip ifadelendirme ve biyomalzemekondrosit ilişkisini gözlemlemek amacıyla yapılan SEM analizleri bulunmaktadır. Kolajen fenotip ifadelendirme için sırasıyla kondsositlerden RA izolasyonu ve cDA sentezi yapılır, PCR yöntemiyle uygun primerler kullanılarak kolajen fenotip tayini için örnekler agaroz jel elektroforezde yürütülerek tip ifadelendirilmesi gerçekleştirilir. SEM analizi ise hücrelerin bulundukları biyomalzeme ile uyumluluğunu göstermek ve yüzeysel görüntülerini elde etmek amacıyla yapılmıştır. Sonuçlara bakıldığında 30 hastada da Kolajen Tip II ekspresyonu gözlenmiştir. Fakat 13 hastada sadece tip II, 17 hastada ise Tip I ve II ekspresyonu birlikte saptanmıştır. SEM analizleri sonucunda kolajen matrikse gömülü kondrosit hücrelerinin inkübasyonun 7.gününden itibaren kendi ECM sentezini yaptıkları ve bulundukları biyomalzemeye tutunarak entegre oldukları gözlenmiştir. Anahtar Sözcükler: Kıkırdak doku tamiri, kolajen fenotip, SEM, matriks biyouyumluluk Abstract: CaReS® is a transplantation technology based on patented 3D Collagen type matrix, which quickens and optimises the regeneration period of hyalin cartilage. In this study, there exists collagen phenotype expression done on 30 patients and SEM (Scanning Electron Microscopy) analysis to observe the biomaterial-chondrocyte compatability. For the collagen phenotype expression RA isolation and cDA synthesis from chondrocytes are done, respectively; collagen phenotype determination is done by using proper primers via PCR method and the samples are run in agarose gel electrophoresis thus type expression is achieved. SEM analysis is done to show the biomaterial – cell biocompatibility and the surface appearance of the matrix. When examining the results, Collagen Type II expression is observed on 30 patients. However, 13 patients exhibit just Type II expression, 17 patients exhibit both Type I and Type II expression. At the end of the SEM analysis, it is observed that the cells embedded in collagen matrix sythesize their own ECM since the 7th day of cultivation and they attach to the biomaterial and integrate successfully. Keywords: Cartilage tissue repair, collagen phenotye, SEM, matrix biocompatibility Doku mühendisliği ve rejeneratif tıp canlı hücrelerin çeşitli yollarla çoğaltılmasını, bunların teşhis, test ya da tedavi amaçlı uygulamalarda kullanılmasını kapsar. Bu bilimdalı altında biyomalzemeler, hücreler, biyomoleküller, mühendislik ve tasarım, tasarım biyomekaniği ve doku mühendisliğini destekleyici enformatik gibi konular çalışılmaktadır. Biyomalzemeler, canlı dokuyla ilişkiye girme kapasitesi olan doğal ya da yapay malzemelerdir. Bu maddeler, son yıllarda, tıp cihazları endüstrisine büyük katkı sağlamıştır. Günümüzde biyomalzemeler yalnızca anatomik yapıların yerine geçmekle kalmayıp, aynı zamanda vücuttaki yenilenme yeteneği olmayan doku ve organların doğal yenilenme mekanizmasını da uyarırlar. Kıkırdak hasarı bazen travmatik bazen bir başka rahatsızlık neticesinde gelişir. Kıkırdak doku organizmada rejenerasyon kabiliyeti en zayıf dokulardan biridir. Bunun nedeni; eklem kıkırdağında travmatik bir lezyon oluştuğunda organizma oluşan hasarı fibröz kıkırdak dokusu ile onarmasıdır. Eklem kıkırdak defektlerinde hiyalin kıkırdak yerine fibröz kıkırdak gelişimi bölgedeki defektin daha kronikleşmesine ve ilerleyen dönemlerde artrozisle sonuçlanmasına neden olmaktadır. Mevcut tedavi metotlarının sınırlı etkileri nedeniyle doku mühendisliği teknikleri kullanılarak kıkırdak dokunun uygun rejenerasyonu için günümüzde in vitro kondrosit üretimi üzerine çalışmalar ağırlık kazanmıştır. Son dekatta kıkırdak yaralanmasının tedavisine yeni doku mühendisliği yöntemlerinin girdiği görülmektedir. Otolog kondrosit transplantasyonu (OKT) yöntemi 1994 yılında ilk kez Brittberg ve ark.[1] tarafından tanımlamıştır. Burada amaç kişinin kendisinden alınan kırdak hücrelerinin doku kültüründe çoğaltılarak yaralanan bölgeye geri uygulanmasıdır. Peterson ve arkadaşları.[2] 2002 yılında yayınladıkları çalışmalarında OKT yi patella veya femoral kondral yaralanma bölgesine uyguladıklarını bildirmişlerdir. Adı geçen grup, ortalama 7.4 yıl izledikleri 61 hastanın 50’sinde 2 yılın sonunda başarılı sonuçlar elde etmişlerdir. Aynı çalışmada, ikinci artroskopide elektromekanik indentasyon probuyla muayenede normal kıkırdağın %90’ına ulaşan mekanik sağlamlık gösterilmiştir. Aynı grup, oniki biyopsi örneğinden sekizinde hiyalin kıkırdağın varlığını destekleyen safranin-O ile boyanma ve sekiz hiyalin kıkırdak biyopsisinden üçünde ise pozitif tip 2 kollajen immünreaktivitesi saptamıştır. Browne ve arkadaşları[3] 2005 yılında yayımladıkları çok merkezli kohort bir OKT çalışmasında beş yıllık izlemlerinde oldukça olumlu sonuçlar bildirmişlerdir. Ortalama yaşın 39 ve defekt boyutunun 4.9 cm2 olarak belirlendiği çalışmada hastaların % 70’i daha önceden en az bir başarısız cerrahi girişim geçirdiklerini bildirmiştir. Cincinnati skorlamasına göre 87 hastada 2.6 puan ortalama iyileşme saptanmıştır. Tüm olumlu sonuçlarına karşın tek başına hücre aktarımının başlıca sorunları (a) aktarılan hücrelelerin sayısının fazlalığı, (b) cerrahi sonrası yaralanma bölgesinde hücre sayısında hızla belirgin azalma, (c) hücrelerin yaralı bölgede homojen olmayan dağılımı ve (d) arzulanan normal kıkırdağın oluşumunun her olguda gözlenmemesi gelmektedir. Bu nedenle günümüzde bireyden alınan kıkırdak hücrelerinin aktarımının tek başına değil de yapay bir ağ (matriks) içinde yaralı bölgeye uygulandığı teknikler öne çıkmaktadır. Bu yöntemle OKT’nin dezavantajları aşılarak daha az hücre ile bunların yaralı bölgede homojen dağılımı sağlanarak dengeli kıkırdak onarımı sağlanabilineceği bildirilmektedir. Seçilen hücre ve taşıyıcı yapay ağ doku mühendisliğinde önemlidir. Uygun hücre ile uygun ağın birlikte kullanımı sistemin temelini oluşturmaktadır. Evrensel boyutta ticari olarak bulunan kıkırdak doku mühendisliği ürünleri incelendiğinde tümünün otolog hücre kullandığı ancak kullanılan yapay ağlar arasında farklar olduğu görülür. Yapay ağlar için uygulandığı doku ile uyumlu, dayanıklı, kullanılan hücrelerle uyumlu ve üremelerine olanak sağlayan gözenekli malzemeleri tanımlamak gerekir. Polimer malzemeler, hücreler ile kaynaşarak mekanik anlamda dayanıklı yapılar oluşturmaları nedeniyle yaygın olarak ağ amacıyla kullanılır. Polimerin fibröz ağ, gözenekli sünger/köpük ve hidrojel gibi çok çeşidi bulunur. Polikarbolakton, polietilen glikol ve doğal kollajenler (kollajen ve hyaluronik asit) çalışmalarda ağ malzemesi olarak sıklıkla tercih edilir[4]. Şekil 1: Kıkırdak Hücre Kültürü ve Đmplantasyon Bir başka çalışmada ise Gigante ve arkadaşları yer almış ve çalışmalarında kollajen membrana implante edilmiş hücrelerin dağılımlarının, uygulanabilirliğinin ve fenotip ekspresyonunun değerlendirilmesi amaçlamışlardır.12 hasta üzerinde yapılan bu çalışmada da MACI yöntemi uygulanmış her membrandaki kalan bölge kolorimetrik, histokimyasal ve ultrayapısal analizlerle değerlendirilmiştir. Tüm örneklerde çok sayıda hücrenin homojen bir şekilde dağıldığı görülmüştür. Bu hücrelerde farklılaşmış hyalin kondrositlerini ifade etmektedir. Bu sonuçlara göre Cherubino ve ark. yaptığı çalışmaya paralel olarak MACI yöntemi kıkırdak hasarının tamirinde klinikte rahatlıkla kullanılabilecek faydalar sağlamaktadır. [5]. CaReS® hiyalin kıkardağın rejenerasyon sürecini hızlandıran 3D Kollajen Tip I matriksine dayanan yenilikçi bir transplantasyon teknolojisidir. Patentli rat kuyruklarından elde edilen 3D-Hücre-Kollajen Tip IMatriks; yüksek derecede kontrol edilebilir hücre aktivite ve fonksiyonelliği ile Kolajen Tip II sentez için hemen hemen doğal bir ortam sunar. II. MATERYALLER ve YÖTEMLER Kondrosit Đzolasyonu Hastadan artroskopi yöntemiyle alınan kıkırdak biyopsisi önce mekanik sindirime tabi tutulur. Sonra 1,25U/mL kollajenaz NB6 (Serva, Heidelberg, Germany) serum içermeyen DMEM Ham’s F12 (Bioconcept, Allschwil, Switzerland) ile 10x seyreltme yapılarak (son enzimatik aktivite 0,125U/mL) parçalanan biyopsi parçaları inkübatörde 37°C, %5CO2,%95rH koşullarında 20±4 saat inkübe edilir. Kondrositlerin Biyomalzemeye Entegrasyonu Elde edilen hücreler, hastanın serumundan hazırlanan 10% otolog medya ile 480xg 10dakika döndürülerek 2 kez yıkanır. Pelette bulunan hücreler öncelikle otolog olarak hazırlanan jel nötralizasyon solüsyonunda pH=7,8 [10x DMEM Ham’s F12 (Bioconcept, Allschwil,Switzerland), Hepes (Sigma,Canada,USA), %7,5NaHCO3 (Biocencept, Allschwil,Switzerland)] çözülür ve kolajen matriks(Arthro Kinetics, Krems, Austria) ile birleştirilerek 20dk 37°C’de beklenerek jelleşme sağlanır. Jelleşme sağlandıktan sonra 6 kuyucuklu tabakta bulunan kıkırdak transplantların üstüne 3mL otolog medya eklenir ve 37°C, %5CO2, %95rH koşullarında kültivasyona bırakılır. Her 3-4 günde bir otolog medya tazelenir. RA Đzolasyonu Kültivasyonun 8. ve 10.günleri arası kolajen fenotip ekspresyonu tayini için örnekleme yapılır. Test edilecek jel 1.25U/mL kolejenaz solüsyonu (Serva,Heidelberg,Germany) içerisinde, jel tamamen çözünene kadar 37°C’de inkübe edilir. Đnkübasyon sonunda bir miktar hücre ayırılarak hücre sayımı ve canlılık testi yapılır. Kalan kısım RNA izolasyonu için santrifuj edilir. RNA izolasyonu RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) kullanılarak gerçekleştirilir. Santrifuj edilmiş hücre süspansiyonundan pellet ayrılarak hücre sayım sonucuna göre belirtilen miktarda RLT tampon çözeltisine konur. Hücre Sayısı < 5 x 106 5 x 106-1 x 107 RLT Tampon Çözeltisi(µL) 350 600 Tablo 1 Pelet homojenize edilir. %70’lik etanol eklenerek pipetleme yapılarak RNeasy kolonuna yerleştirilir ve 13000rpm’de santrifuj edilir. Supernatan atılarak RW1 tampon çözeltisi RNeasy kolonuna eklenir ve 13000rpm’de tekrar santrifuj edilir. Santrifuj sonunda supernatan ve toplama tüpü atılır ve yeni bir RNeasy kolonu kullanılarak üzerine RPE tampon çözeltisi eklenerek santrifuj edilir. Supernatan atılarak yeniden RPE tampon çözeltisi eklenerek RNeasy Silica Jel Membranın kuruması için santrifuj edilir. Bu işlemden sonra RNeasy kolonu, supernatanın temas kolona temas etmemesi sağlanarak toplama tüpünden dikkatlice ayrılır. RNA izolasyonu için RNeasy kolonu başka bir toplama tüpüne aktarılarak üzerine RNase içermeyen su eklenir ve 13000rpm’de santrifuj edilir. Đşlem sonunda 7µL eluent RNA miktarının belirlenmesi için ayrılır. RNA solüsyonu ultra saf su ile seyreltilerek 260nm’de ölçüm yapılır. 260 nm’de RNA miktarı [µg/mL]= OD değeri x 20 x 40 µg/mL formülü ile belirlenir. cDA Sentezi DNA sentezi için First Strand cDNA Sentez Kiti (Roche, Basel, Switzerland) kullanılır. 2µL RNA solüsyonu üzerine 16.4µL PCR water ve 4µL OligodT eklenir. Karışım 5dakika 68°C’de konvansiyanel PCR cihazında inkübe edilir ve 10dakika 4°C’de konvansiyanel PCR cihazında soğutulur. PCR Tüplerinde her örnek için birer birim Master-Mix hazırlanır: Bileşen Miktar (µL) 10 x Reaksiyon Buffer 4 dNTPs MgCl2 (25mM) RNase-inhibitör 4 8 2 Revers transkriptaz 1.6 Sıcaklık Süre(Dk) Oligo-dT’nin yapışması 25°C 10 Revers Transkripsiyon 42°C 60 Revers Transkriptazın Đnaktive olması 99°C 5 4°C Tablo 3 5 Soğuma Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kolajen Tip I, II ve Betamikroglobulin için aşağıdaki solüsyon ayrı ayrı hazırlanır. Bileşen PCR Master-Mix PCR Water Đleri primer (10 µM) Geri primer (10µM) Miktar (µL) 25 20 2 2 Tablo 4 94 °C 60 sn 54 °C 30 sn 72 °C 90 sn Tablo 5 Master mix hazırlandıktan sonra her 49 µL’şer mastermikse 1’er µL cDNA eklenir. PCR Thermocycler’da Tablo 5’teki gibi gerçekleştirilir. Bu basamaklar 34 devir devam eder. Daha sonra 4°C 10 dakika soğuma evresi uygulanır. Örnekler % 1.5’luk Agaroz jelde yürütülür. Sonuçlar β2-Mikroglobulin 300bp’de bantlar Kolajen Tip I 600bp’de bantlar Kolajen Tip II 500bp’de bantlar SEM Analizi Kültive edilen konrositlerin içinde bulunan kolajen matriks 3 saat 2,5% gluteraldehit/PBS (Sigma,Canada,USA) içinde fiksasyona tabi tutulur. Daha sonrasında PBS ile 2 kez yıkama yapılarak SEM örnek hazırlama için 72 saat kurumaya bırakılmıştır. Kuruma tamamlandıktan sonra SEM mikroskobuna numuneler yerleştirilmiş ve görüntüleme yapılmıştır. III. SOUÇLAR Kolajen Fenotip Đfadelendirme 30 hasta üzerinde yapılan bu çalışmada 13 hastada sadece Tip II, 17 hastada ise Tip I ve Tip II ifadesi birlikte gözlenmiştir. Tablo 2 Aşama Her RNA-Oligo-dT karışımına 19.6 µL Master-Mix eklenir ve örneklerin çoğalması Tablo 3’teki gibi Thermocycler’da gerçekleştirilir. Jel fotoğrafında da gözlendiği gibi Kol I 600bç, Kol II 500bç ve β2M(β mikroglobulin) 300bç’inde sinyal vermektedir. Birer örnek teşkil etmesi açısından C07007 kodlu hastada Tip I ve Tip II bantları birlikte sinyal vermiş, C07-008 numaralı hastada ise sadece Tip II sentezi gerçekleşmiştir. β2M ifadesi PCR marker olarak uygulanır ve yapılan PCR işleminin başarılı olarak yapıldığının kanıtıdır. SEM Analizi ECM kondrosit Şekil 2: SEM görüntüsü ( Đnkübasyonun 8.günü) – 4000X Kolajene gömülü kondrositler inkübasyonun 8.gününde alınmış ve gluteraldehit ile fiske edilmiştir daha sonrasında PBS ile yıkandıktan sonra 72 saat kurumaya bırakılmıştır. Kolajen fenotip ifadelendirilmesi dikkate alındığında tüm uygulamalarda Kolajen Tip II sentezinin olduğu PCR yöntemiyle saptanmıştır. Tip I Kolajen içerisine gömülen kondrositlerin protein ekspresyonu, hücre kültür periyodu boyunca Tip II’ye çevrilmektedir. Bu anlamda kullanılan Tip I kolajen matriks içerisinde çoğaltılan kondrositler, kendi karakterlerini koruyarak Kolajen Tip II sentezi yapmışlar ve kendi ECM’lerini sentezlemişlerdir. 13 hastada PCR yolu ile sadece Kolajen Tip II sentezi, 17 hastada ise Kolajen Tip I ve Tip II’nin birlikte bulunduğu gözlenmiştir. Bu da kültivasyon süresince tip II sentezinin devam ettiğine bir kanıt teşkil etmektedir. In vivo ortamda da kondrositler kolajen matriks içerisinde kolajen Tip II sentezi yapmaya devam edecek ve kıkırdak tamirinde görev alacaklardır. Kolajen fenotip ifadelendirmesine paralel olarak SEM görüntüleri de elde edildiğinde bulunan sonuçların birbirini desteklediği gözlenmiştir. Görüntülerden de anlaşılacağı gibi gerek kondrositlerin kolajen fibril senteziyle biyomalzemeye entegrasyonu gerekse birbirlerine tutunumları başarılıdır. Kolajen fenotip ifadelendirmesi ve SEM analizi dikkate alındığında kullanılan jel formundaki kolajen matriks(Collagen MS) ile kondrositlerin birbiriyle biyouyumlu olduğu saptanmıştır. TEŞEKKÜR SEM analizi çalışmalarındaki yardımlarından dolayı Doç. Dr. Petek Korkusuz’a (Hacettepe Üniversitesi Histoloji ve Embriyoloji) teşekkürü borç biliriz. KAYAKLAR Şekil 3: SEM görüntüsü ( Đnkübasyonun 8.günü) – 2000X SEM görüntülerinden de gözlendiği gibi inkübasyonun 8.gününden itibaren kondrositler kendi ECM’lerini sentezleyerek hem birbirlerine hem de gömülü oldukları 3D kolajen matriks fibrillerine başarıyla tutunmuşlar ve sayısal anlamda artış göstermişlerdir. IV. TARTIŞMA Kondrosit transplantasyon yönteminde eklemin yük taşımayan bölgelerinden cerrahi girişim ile hiyalin kıkırdak örnekleri alınmakta, laboratuar ortamında kondrositler matriksten ayrılmakta, in-vitro olarak çoğaltılmakta ve farklı taşıyıcı ortamlara (matrix) yerleştirilerek eklem içine enjekte edilmekte ya da doğrudan lezyonlu bölgeye yerleştirilmektedir. Bu kondrositlerin içerisinde implante edildikleri matriks malzemesini tip II kollajene dönüştürmesi veya tip II kollajeni sentezleyerek kaybolan kıkırdak matriksini yerine koyması beklenmektedir. [1] Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O, Peterson L.Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 1994 Oct6; 6;331(14):889-95. [2] Peterson L, Brittberg M, Kiviranta I, Akerlund EL, Lindahl A. Autologous chondrocyte transplantation. Biomechanics and long-term durability. Am J Sports Med. 2002;30:2-12.) [3] Browne JE, Anderson AF, Arciero R, Mandelbaum B, Moseley JB Jr, Micheli LJ, Fu F, Erggelet C. Clinical outcome of autologous chondrocyte implantation at 5 years in US subjects. Clin Orthop Relat Res. 2005;436:237-245. [4] Stock UA; Vacanti JP. Tissue engineering: Current state and prospects ANNUAL REVIEW OF MEDICINE 2001 52: 443-451 [5] Gigante et.al.,Membrane-seeded autologous chondrocytes: cell viability and characterization at surgery , Knee Surgery, Sports Traumatology, Arthroscopy, 2007, 15:1: 88-92