lc-tandem ms-mrm temel araştırma ve klinik laboratuvarda kullanımı
Transkript
lc-tandem ms-mrm temel araştırma ve klinik laboratuvarda kullanımı
LC-TANDEM MS-MRM MS-MRM LC-TANDEM TEMEL ARAŞTIRMA ARAŞTIRMA VE VE TEMEL KLİNİK LABORATUVARDA LABORATUVARDA KULLANIMI KULLANIMI KLİNİK Prof.Dr. Dr.Hüray HürayİŞLEKEL İŞLEKEL Prof. DokuzEylül EylülÜniversitesi ÜniversitesiTıp TıpFakültesi Fakültesi Dokuz Aralık2011 2011-- ADANA ADANA 11Aralık Kütle Spektrometresi Tarihsel Süreci 2 Kimya Dalında Nobel Bilim Ödülü (2002) (Fenn J. B. ve Tanaka K) • Fenn ve Ta Kütle Spektrometri (MS) Bilinmeyen bileşiklerin tanımlanması Organik ve inorganik moleküllerin yapısal özelliklerinin belirlenmesi Her tipte bilinen bileşiğin kantitasyonu “yüksek duyarlılık ve özgüllükte” analitik bir teknik MS moleküllerin kütlelerini tartar Tek bir hidrojen atomu ağırlığı 1.66 X 10-24 g MS moleküllerin kütlelerini tartar Kütle Spektrometre doğrudan moleküler kütleyi ölçmek yerine molekülleri kütle/yük oranınına (m/z) göre ayrıştırır ve ölçer Moleküller iyonlara dönüştürülmeli (elektriksel olarak + ya da - yüklü olmalı) Gaz fazına geçirilmeli Kütle Spektrometresi İyon kaynağı Kütle Analizörü Atmosferik basınçta molekülün gaz fazına geçirilmesi ve iyonizasyonu Detektör Gaz fazındaki iyonların vakum altında m/z e göre ayrımlanması Veri Analizi m/z Kütle Spektrumu Ayrımlanan iyonların tespiti Kütle Spektrumu + Q 1 : 6 .7 0 0 to 6 .8 3 4 m in fro m S a m p le 8 (M C F ) o f D a ta Q 1 s c a n s M C .w iff, s u b tra c te d (6 .3 9 9 to 6 .5 4 9 ... M a x. 2 .6 e 5 c p s . 2 2 .0 2 .6 e 5 2 .4 e 5 1 7 .0 sinyal yoğunluğu 2 .2 e 5 2 .0 e 5 1 .8 e 5 1 .6 e 5 2 2 .8 1 8 .0 1 0 1 3 .6 1 .4 e 5 1 .2 e 5 -1 8 .0 1 .0 e 5 8 .0 e 4 0 .8 3 8 .0 2 4 .0 1 9 .0 6 .0 e 4 -1 7 .0 3 9 .0 2 .0 4 .0 e 4 -1 6 .0 2 0 .2 2 .0 e 4 3 .0 4 0 .0 2 5 .0 0 .0 990 995 1000 1005 1010 1015 1020 1025 m /z , a m u 1030 kütle/yük (m/z) 1035 1040 1045 1050 1055 1060 LC-MS/MS ile özgül ve duyarlı kantitasyonun sırrı ???? LC-MS/MS ile özgül ve duyarlı kantitasyonun sırrı ???? Kompleks biyolojik karışımların analizinde ilk boyut, kromatografik olarak bileşenlerine ayrımlanma Winnik ve Kitchin, Toxicology and Applied Pharmacology, 2008 LC-MS de her analit için 1. Retansiyon zamanı 2. m/z değeri LC-MS/MS ile özgül ve duyarlı kantitasyonun sırrı ???? Ayrımlanan bileşiklerin iki aşamalı MS analizi ile özgüllük artar (MS/MS) Winnik ve Kitchin, Toxicology and Applied Pharmacology, 2008 Tandem MS (MS/MS) (Sıralı Kütle Analizörü) N2 Girişi RF Ion Guide Q1 Q2 Çarpışma Hücresi İyon seçimi moleküler iyon/ precusor ion Parçalanma Q3 Dedektör İyon seçimi ürün iyon/ product ion Neden Tandem MS (MS/MS) Moleküler iyon parçalanması proteinin peptidlerinin dizilimi helyumla çarpıştırılarak amid bağlarının kopartılması peptidin aa dizilimi Multiple Reaction Monitoring (MRM) Çoklu Reaksiyon İzleme Bileşiklerin kantitasyonunun yüksek duyarlılık ve özgüllükte yapıldığı hedefli bir tandem MS yöntemi PubMed “MRM” “2000-2010” "Multiple Reaction Monitoring" Yayın/yıl 500 400 300 200 100 0 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Yıl Multiple Reaction Monitoring (MRM) Kantitasyonu yapılacak analit/lere özgü ve daha önceden tanımlanmış m/z değerindeki ana iyon ve fragment iyon ikilisi (transition) izlenir. Multiple Reaction Monitoring (MRM) Ana iyon ile fragman ion çifti olarak adlandırılan “transition” kantite edilecek analite spesifik olup, bir ya da daha fazla ürün iyon çifti izlenerek spesifite artırılmış olur. MS analizi süresince tüm m/z değerlerini taramak yerine sadece belirli m/z aralıklarına odaklanılır ve diğerleri göz ardı edilir. Bir dizi transition ile birlikte hedef analitin tam retansiyon zamanı birleşince kesin bir ölçüm olur. Tek bir LC- MS/MS deneyi sırasında birden çok analitin ölçümü mümkündür. Çoklu Reaksiyon İzleme-MRM Triple Quadrupole MS/MS N2 Inlet RF Ion Guide Q1 Q2 Collision Cell Q3 Detector Triple Quadrupole Ion Trap MS/MS N2 Inlet RF Ion Guide Q1 Q2 Collision Cell Q3 Detector İzotop İşaretli İnternal Standart MS öncesi (ekstraksiyon, HPLC enjeksiyonu…) MS koşullarındaki değişiklikleri standardize etmek ve kesin, tekrarlanabilir sonuçlar için İnternal Standart Özellikleri Hedef analit ile kimyasal özellikleri kromatografik ayrımlanma özelliği iyonizasyon etkinliği fragment iyon dağılımı aynı olmalıdır. Tek farkı olmasıdır. analitten daha ağır kütleye sahip MRM Yöntemiyle Kantitasyon Örnek İnternal Standart (örnek pik alanı ) (internal standart pik alanı) x (internal standart konsantrasyonu) MRM-LC-MS/MS ile Kantitasyon Alanları İlaç Düzeyi Belirlenmesi Adli Toksikoloji Tedavi etkinliğinin, tedaviye uyumun ve ilaca bağlı toksisitenin belirlenmesi amacıyla biyolojik sıvılarda ilaç düzeylerinin ölçümü µL örnek hacimlerinde ng, pg düzeyinde duyarlılıkta ölçüm antiepileptik ilaçlar kardiyoaktif ilaçlar bronkodilatörler antibiyotikler antiretroviral ilaçlar antipsikotikler antimetabolitler immunsupresan ilaçlar vb. alkol •Grebe and Sngh Clin. Biochem Rev Feb 2011 Mayo Clinic illegal ilaç ve metabolitleri Yeni Doğan Metabolik Hastalıkları Yeni doğan metabolik hastalıklarının taramasında (NBS) Amino asit analizleri Yağ asidi oksidasyon defektlerinde karnitin, açil karnitin Organik asidemi, asidürilerde organik asitler Doğrulama Tirozinemi I:Tirozin Propionik asidemi:3-OH-propionik asit Metil malonik asidemi:MMA MSUD:Dallı aa lerin analizi CAH:17 OH progesteron Lizozomal depo hastalıkları:Enzim substrat reaksiyon ürünü •Grebe and Sngh Clin. Biochem Rev Feb 2011 Mayo Clinic Hormon/Vitamin/Biyolojik Amin Analizleri Steroid hormonlar Östrojen (E1ve E2) Kortizol Testosteron 25-hidroksi vitamin D HPLC-UV, HPLC-EC RIA Otomatize kemilüminesans immunoasaay College of American Patologists LC-MS/MS i referans yöntem olarak önerdi NIST kalite kontrol materyali (SRM 972) (25OHD2 ve 25OHD 3 ve 3-epi izomerleri) •Grebe and Sngh Clin. Biochem Rev Feb 2011 Mayo Clinic Klinik Laboratuvarda LC-MS/MS Diğer Yöntemler (İmmun Ölçüm-HPLC-GCMS) ile Karşılaştırıldığında DUYARLILIK ÖZGÜLLÜK SONUÇ VERME SÜRESİ Klinik Laboratuvarda LC-MS/MS Diğer Yöntemler ile Karşılaştırıldığında Otomatize immun ölçüm yöntemleri Sonuç verme süresi kısa Sınırlı manuel işlem gerekliliği Özellikle düşük konsantrasyonlarda analitik spesifitesi yetersizliği Sınırlı dinamik aralık Monoklonal antikor gerekliliği Tekrarlanabilirlik yetersizliği Yüksek reaktif maliyeti Radyoaktif atık uzaklaştırılması, uzun inkübasyon süresi, çapraz reaktiviteyi engellemek için organik ekstraksiyon/kromatografi gerekliliği (RIA) GC-MS ve HPLC GC-MS non-polar uçucu ve ısıya dayanıklı metabolit analizinde uygun İş akışının daha uzun (Özellikle GC-MS örnek derivatizasyonu gerektirmesi) Analitik spesifite daha düşük (Özellikle konvansiyonel HPLC) LC-MS/MS ile Ölçüm Sınırlılıkları Örnek hazırlığında manuel işlem gerekliliği Analizin kompleksliği, kullanıcı eğitimi, deneyim gerekliliği Cihazın kurulum maliyeti, bakım ve sürdürülebilirliği 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Yayın/yıl PubMed “Oxidative stress” 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 Yıl PubMed “Oxidative stress” “LC-MS/MS” 60 Yayın/yıl 50 40 30 20 10 0 0 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 0 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 Yıl Oksidatif stres değerlendirmesinde LC-MS/MS kullanımı Oksidatif stres biyobelirteçlerinin çoklu kantitasyonunda örnek hazırlık aşamasında kimyasal derivatizasyon işlemine nadiren gerek duyulması ön ayrımlama işlemleri ve örnek hazırlığı ile ardışık olarak (in-line) kullanılabilmesi yüksek duyarlılık ve özgüllükte analiz *Giustarini, D., et al., Crit Rev Clin Lab Sci, 2009. *Winnik and Kitchin, Toxicology and Applied Pharmacology, 2008 LC-MS/MS ile İzoprostanların Ölçümü LC-MS/MS ile Tiyol Biyobelirteçlerin Ölçümü LC-MS/MS İle Okside Aromatik Amino Asit Ölçümü LC-MS/MS ile 8-OHdG ve İlişkili DNA Biyobelirteçleri Ölçümü 8-Hidroksi-2’-deoksi-guanozin (8OHdG) Oksidatif DNA hasarının klasik bir biyobelirteçi 8OHdG ölçüm yöntemleri: HPLC-ECD GC-MS LC-MS Enzimatik teknikler LC-MS/MS (Avrupa Oksidatif DNA Hasarı Standartlar Komitesi (ESCODD) önerisi) DNA BAZ HASARI ÖLÇÜMÜ İÇİN LC-MS/MS-MRM YÖNTEMİ OPTİMİZASYON VE GEÇERLİ KILMA ÇALIŞMALARI 8OHdG (8-hidroksi-2‘ deoksiguanozin) O . HN H2 N N H N N HO H C4-OH-adduct radical O HN H2 N O OH N H N N H guanine + . OH N HN H2 N N . H N H C5-OH-adduct radical O N HN H2 N . N -eOH H N H C8-OH-adduct radical ,-H+ O N HN H2N OH N N DNA 8-hydroxyguanine ScdA (8,5'-siklo-2‘ deoksiadenozin ) Gereç ve Yöntem LC-MS/MS HPLC (Shimadzu LC-20AD) Triple Quadrapole Ion Trap LC-MS/MS (Applied Biosystems 4000 Q-TRAP) Elektrosprey iyonizasyon (Turbo V iyon kaynağı) MRM-pozitif iyon modu Analyst Software Version 1.5 LC Koşulları Kolon Özellikleri: RP C18, 2.1 mm x 150 mm, 3.5 μm Guard kolonu: 2.1 mm x 12.5mm, 5 μm Mobil faz: %2 Asetonitril, %95 dH2O Akış hızı: 0.3 mL/dk Enjeksiyon hacmi: 10 – 20 μL MS Koşulları Kaynak bağımlı parametreler Bileşik bağımlı parametreler curtain gas: 10 psi DP: 61 ion spray voltage: 5.500 V EP: 10 temperature: 500 °C CE: 25 ion source gas 1: 50 psi CXP: 10 ion source gas 2: 50 psi dwell time: 150 ms duration time: 26 dk MRM Ana İyon/Ürün İyon Çiftleri ScdA ScdA 15N5 8OHdG 8OHdG 15N5 MRM Transition (m/z) 250/164 255/169 284/168 289/173 Retansiyon Zamanı (dk) 4.7 4.7 5.3 5.3 Sonuçlar S-cdA Fragmantasyonu 250 N H 2 N m /z 1 6 4 H O + H H N C N Ana iyon N O H H O H H H H 164 Ürün iyon 8-OH-dG Fragmantasyonu O 168 N NH HO Ürün iyon N HO N NH2 + m /z 1 6 8 (B H 2 ) +2H CH2 O H H H OH H H m /z 1 1 7 (S + ) 284 Ana iyon S-cdA İyon Kromatogramı (0-26 dk) Intencity (cps) S-cdA RT: 4.72 dk Retansiyon zamanı (dk) 8-OH-dG İyon Kromatogramı (0-26 dk) Intencity (cps) 8-OH-dG RT: 5.32 dk Retansiyon zamanı (dk) 8-OH-dG Standart Grafiği ( 0.2, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50 pmol/mL) (n:2) ScdA Standart Grafiği (0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 2.5, 5, 10, 25 pmol/mL) (n:2) konsantrasyon (pmol/mL) İdrar S-cdA İyon Kromatogramı Intencity (cps) R-cdA m/z 250.0 → 164.0 S-cdA m/z 250.0 → 164.0 R-cdA15N5 m/z 255.0 → 169.0 RT: 4.02 dk S-cdA15N5 m/z 255.0 → 169.0 RT: 4.84 dk Retansiyon zamanı (dk) Intencity (cps) İdrar 8-OH-dG İyon Kromatogramı 8-OH-dG m/z 284.0 → 168.0 8-OH-dG15N5 m/z 289.0 → 173.0 RT: 5.38 dk Retansiyon zamanı (dk) Gün-içi Tekrarlanabilirlik Ortalama (pmol/mL) (n=10) SD % CV S-cdA 0,25 0,0121 4,94 8-OH-dG 0,20 0,0106 5,24 Günler-arası Tekrarlanabilirlik Ortalama (pmol/mL) (n=10) SD % CV S-cdA 0,15 0,0137 9,25 8-OH-dG 0,14 0,0031 2,31 En Düşük Tespit Limiti (LOD) En Düşük Kantitasyon Limiti (LOQ) LOD LOQ S-cdA 1,1x10-3 pmol/mL (S/N =3.5) 4,4x10-3 pmol/mL (S/N=12.6) 8-OH-dG 1.8x10-4 pmol/mL (S/N=3.6) 5,8x10-4 pmol/mL (S/N =11) İnternal Standart Kullanarak İdrar Örneklerinde S-cdA Kantitasyonu S-cdA S-cdA 15N5 *S-cdA S-cdA Ana İyon Ana İyon 164/169 (pmol/mL) (nmol/L) 164 169 İdrar Örneği Kreatinin (mmol/L) S-cdA (nmol/ mmoL kreatinin) 1.Örnek 14000 53300 0,26 0,24 0,24 6,26 0,04 2.Örnek 18500 130000 0,14 0,13 0,13 14,23 0,01 3.Örnek 16900 42100 0,40 0,37 0,37 18,25 0,02 4.Örnek 23700 138000 0,17 0,16 0,16 3,56 0,04 *S-cdA (pmol/mL)= (0,26)ax(0.076 mM)bx(24µL)cx(1000)d/(2000)e a: 164/169 pik alanlarının oranı b: İnternal standart konsantrasyonu c: Eklenen internal standart miktarı d: µL’den mL’ye dönüşüm faktörü e: İnternal standart dilüsyon faktörü İnternal Standart Kullanarak İdrar Örneklerinde 8-OH-dG Kantitasyonu İdrar Örneği 8-OH-dG 8-OH-dG15N5 Ana İyon Ana İyon 168 173 168/173 *8-OH-dG (pmol/mL) 8-OH-dG (nmol/L) 8-OH-dG nmol/ Kreatinin mmoL kreatinin (mmol/L) 1.Örnek 108000 2380000 0,05 0,20 0,20 6,26 0,03 2.Örnek 398000 5320000 0,07 0,33 0,33 14,23 0,02 3.Örnek 284000 2910000 0,10 0,43 0,43 18,25 0,02 4.Örnek 359000 9110000 0,04 0,17 0,17 3,56 0,05 *8-OH-dG (pmol/mL)= (0,05)ax(0.092 mM)bx(2.4µL)cx(1000)d/(50)e a: 168/173 pik alanlarının oranı b: İnternal standart konsantrasyonu c: Eklenen internal standart miktarı d: µL’den mL’ye dönüşüm faktörü e: İnternal standart dilüsyon faktörü Normal Akciğer Dokusunda S-cdA ve 8-OH-dG S-cdA R-cdA R-cdA15N5 S-cdA15N5 8-OH-dG 8-OH-dG15N5 Tümörlü Akciğer Dokusunda S-cdA ve 8-OH-dG S-cdA R-cdA R-cdA15N5 S-cdA15N5 8-OH-dG 8-OH-dG15N5 AKCİĞER KANSERİNDE OKSİDATİF HASARIN DOKU VE İDRARDA DNA BAZ HASARI VE 8-İZOPROSTAN DÜZEYLERİ İLE GÖSTERİLMESİ DİYET ALAN FENİLKETONÜRİLİ ÇOCUKLARDA FONKSİYONEL B12 VİTAMİN EKSİKLİĞİNİN İNCELENMESİNDE MMA VE HOMOSİSTEİN DÜZEYLERİNİN BELİRLENMESİ Genetik ve Biyokimya İnsan genom projesinin sonlanması İnsan Genom Projesinin ilginç bir sonucu: mRNA ve protein sayılarının arasındaki zayıf korelasyonun ortaya konması İnsan genomunda 25-30 000 protein kodlayan gen İnsan proteomu > 500 000 protein White House Press Release, June 26, 2000 Proteomiks &MS (PubMed) Proteomiksde MRM uygulama alanları EKSPRESYONEL PROTEOMİKS Protein Tanımlama Doku hücre, organel vb proteinleri Protein Ekspresyon Analizi (göreceli & mutlak kantitasyon) Bir duruma özgü proteinler tanımlanması (diferansiasyon, evre, ilaç yanıtı vb) Protein Biyobelirteç Keşif (Discovery) Doğrulama (Verification) Geçerlilik onaylama (Validation) FONKSİYONEL PROTEOMİKS Proteinler arası etkileşim analizi Biosentez yolları, sinyal yolakları, multiprotein karışımlar Protein modifikasyon haritalaması (PTM analizi fosforilasyon,glikozilasyon, oksidasyon vb) MRM Yöntemiyle Protein Kantitasyonu Metot Geliştirme Basamakları Hedef Protein Hedef Peptid Kütle Yü k Q1 öncül iyon m/z Q2 transition m/z /öncül/ürün iyon çifti: 744.8/959.4 MRM Yöntemiyle Protein Kantitasyonu MRM Yöntemiyle Protein Kantitasyonu MRM Yöntemiyle Protein Kantitasyonu MRM Yöntemiyle Protein Kantitasyonu MRM Yöntemiyle Protein Kantitasyonu 76 İnsan Plazmasındaki Proteinlerin “Dinamik Aralığı” 1,000,000,000 Albumin, IgG 100,000,000 Apolipoprotein E 10,000,000 amol/uL plazma 1,000,000 100,000 L-selectin 10,000 1,000 IL-8 100 10 1 0 0 10 20 30 40 50 60 Plazma Proteinleri Anderson, N.L. and Anderson, N.G., Molecular & Cellular Proteomics, 2003, 2(1): 50. Örnek Hazırlama Yaklaşımları MRM-Metabolomiks (<1500 Da) Hedefli olmayan Hedefli Hücre, doku ya da organizmada bulunan tüm bilinen ve bilinmeyen (100-1000 lerce) metabolitin incelenmesi Belirlenmiş metabolitlerin (10-100 lerce) kantitasyonu Amino asitler ve türevleri Şeker fosfatlar Nukleotidler Koenzim A ve türevleri Karboksilik asitler Lipidler ve türevleri….. Hastalık metabolizması Hücresel metabolik olaylar Terapotik hedefler İlaçların etki mekanizmaları Var olan biyobelirteçlerin validasyonu….. Grubumuz Ar. Gör.Melis KANT Ar. Gör. Merve Akış Ar. Gör. Gamze TUNA (DEÜTF Tıbbi Biyokimya AD) Teşekkür… Prof. Dr. Güldal KIRKALI Prof. Dr. Miral DİZDAROĞLU (NIST/Washington DC)