Klinik Proteomikle İlgili Yanlış Olan Nedir
Transkript
Klinik Proteomikle İlgili Yanlış Olan Nedir
Klinik Proteomikle İlgili Yanlış Olan Nedir? Moderatörler: Ashley Di Meo1 ve Eleftherios P. Diamandis2,3,4* Uzmanlar: Henry Rodriguez5, Andrew N. Hoofnagle6, John Ioannidis7 ve Mary Lopez8 1Yüksek Lisans Öğrencisi, Tıbbi Laboratuvar ve Patobiyoloji Bölümü, Toronto Üniversitesi, Toronto, Ontario, Kanada; 2Başkan, Klinik Biyokimya Birimi, Tıbbi Laboratuvar ve Patobiyoloji Bölümü, Toronto Üniversitesi, Toronto, Ontario, Kanada; 3Başkan, Klinik Biyokimya Birimi, Patoloji ve Tıbbi Laboratuvar Bölümü, Mount Sinai Hastanesi, Toronto, Ontario, Kanada; 4Baş Biyokimyacı, Klinik Biyokimya Bölümü, Üniversite Sağlık Ağı, Toronto, Ontario, Kanada; 5Büro Yöneticisi, Kanser Klinik Proteomik Araştırmalar Bürosu, Stratejik Bilimsel İnsiyatifler Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD; 6Başkan, Klinik Kimya Birimi, Yönetici, Klinik Kitle Spektrometri, Yönetici Yardımcısı, Klinik İmmünoloji, Yönetici, Beslenme ve Obezite Araştırmaları Merkezi, Analitik Çekirdek, Washington Üniversitesi, Seattle, WA; 7Tıp Profesörü, Stanford Üniversitesi Hastalıkları Önleme Kürsüsü, Başkan, Stanford Önleme Araştırmaları Merkezi, Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi, Stanford, CA; 8Yönetici, BRIMS Merkezi, Thermo Fisher Scientific, Cambridge, MA. Bu yazarın iletişim bilgileri: Department of Pathology and Laboratory Medicine, Mount Sinai Hospital, 6th Floor, Rm 6-201, Box 32, 60 Murray St., Toronto, Ontario, Canada MST 3L9. Faks 416-619-5521; e-posta ediamandis@mtsinai.on.ca. Standart dışı kısaltmalar: MS, kitle spektrometri; FDA, Gıda ve İlaç Yönetimi; PSA, prostata özgü antijen; MRM, çoklu tepkime izleme; CDx, yardımcı diyagnostikler. Proteomik terimi proteinler, özellikle de yapıları ve işlevleri ile ilgili yapılan büyük ölçekli çalışmaları tanımlamak için kullanılır. Klinik proteomik ise bu alandaki yeni keşif ve teknolojilerin hasta bakımına uyarlanmasını amaçlar. Proteomik konusundaki yapı taşlarından biri kitle spektrometrisidir (MS). Son birkaç yılda MS-temelli proteomik alanında büyük gelişmeler kaydedilmiştir. Birkaç saat içinde karmaşık vücut sıvıları, dokuları ve hücrelerinin protein yapısının neredeyse tamamen anlaşılması mümkün hale gelmiştir. Kitle spektrometri cihazlarının daha hızlı ve daha duyarlı hale gelmesiyle proteinlerin birincil yapıları, geçiş sonrası dönüşümleri, eklenme değişkenlikleri ve mutasyonları hakkında ayrıntılı bilgiler elde edilmiştir. Karmaşık karışımlarda bulunan proteinlerin saptanmasındaki duyarlılığın artışı halen proteomikin ilgi alanındaki bir konudur. Yeni cihazlar ve yeni numune hazırlama yöntemleri geliştirilmekte ve karmaşık karışımlardaki bileşenlerin daha hızlı ve daha duyarlı bir şekilde ölçülmesi sağlanmaktadır. Bu yöntemler antikorlar ve diğer bağlayıcılar kullanılarak bileşen zenginleştirme aşamalarına gerek duyabilirler. Bu gelişmeler ışığında MS-temelli proteomikin protein yapısı ve işlevi ile ilgili yeni bilgiler sağlaması ve yeni keşiflerin kliniğe uyarlanması ile tıbbi bilimlerde bir devrim yaratması beklentisi oluşmuştur. Konuyu daha da açmak gerekirse tanı, takip ve tedavi belirleme aşamalarında kullanılacak yeni belirteçlerin keşfedilmesi umudu doğmuştur. MS-temelli proteomikin çok parametreli olması farklı biyolojik sıvıların incelenmesinin klinik uygulamaya girmesine olanak sağlamıştır. Ancak 15 yıllık bir çabaya rağmen MS-temelli proteomik sayesinde yeni bir belirteç bulunamamıştır. NIH gibi kamu otoriteleri ve diyagnostik firmaları şimdiden yüzlerce milyon dolar harcadığına göre, bu sorun maddi kaynakların yetersizliğinden kaynaklanmıyor gibi görünmektedir. Bu soru-yanıt bölümünde dört uzmanla neden böyle olduğunu ve gelecekte neler beklenebileceğini tartışıyoruz. Proteomikten biyolojik kaynaklanmıştır? belirteçlerin yeni neslinin doğacağı beklentisi nereden Henry Rodriguez: 2000 yılının sonlarında insan genomunun taslağı (genomik) ortaya konduktan sonra bilimsel karşılığına (proteomik) yönelik ilgi artmaya başlamıştır. Temel üç katmanlıdır: birincisi, proteinlerin hücrenin yük atları, yani yapısını ve işlevselliğini oluşturan mekanizma olduğu, dolayısıyla fenotip özellikleri belirlediği biyolojik olarak gösterilmiştir; ikincisi, araştırıcılar olası genetik ürünlerin kaynaklarını belirleyebilmiştir (insan genomu); üçüncüsü, ilaç endüstrisi bizzat kendileri protein olan ya da proteinleri hedefleyen ürünler geliştirmeye başlamıştır. Bu gerçeklerle birlikte çok sayıda protein ve geçiş sonrası modifikasyonlarının teknolojik gelişmeler sayesinde belirlenir hale gelmesi bu alanın niye bu kadar ilgi çektiğini anlaşılır kılmaktadır. Sorulacak soru araştırmacıların bugün için elde bulunandan fazlasını bekleyip beklemediğidir. Bugün için genom dizilimi için yapılanların büyük ölçekte proteinleri anlamayı kolaylaştıracağını söylemek, zor olsa da karşılanabilir bir beklentidir. Andrew N. Hoofnagle: Son 25 yılda kademeli olarak insan genomundaki nadir görülen polimorfizm ve epigenetik modifikasyonları saptamanın ve yorumlamanın zor olduğunu öğrendik. Belki daha da önemlisi, özgün genetik modifikasyonların yakın ya da uzak diğer genetik modifikasyonlar ve çevre ile nasıl etkileşeceğini ve proteinlerin ekspresyonunu, yerleşimini ve geçiş sonrası düzenlenmesini ne şekilde etkileyeceğini bilmenin imkansız olduğunu gördük. Sonuç olarak, insan genomunun istenen şekilde belirlenmesi genomun kendisinin değil, oluşturduğu proteinlerin ekspresyonu, bu proteinlerin hücrelerdeki yerleşimi ve geçiş sonrası değişimlerinin anlaşılmasıdır denebilir. Böylece genom ile çevrenin insanın oluşumuna birlikte nasıl etki ettiği açığa çıkacaktır. Bir hastanın fenotipi gerçekte milyarlarca farklı hücrenin proteom ve metabolomu olarak tanımlanır. Genotip fenotip belirleyicilerinden yalnızca bir tanesidir. İnsan organizmasının belli bir zaman noktasındaki durumunun değerlendirilmesinde fenotipin genotipe göre çok daha önemli olduğu varsayıldığından, proteomikten bir hastalığın tanısı, prognozunun belirlenmesi ve tedavi etkinliğinin izlenmesinde kullanılacak yeni biyolojik belirteçler oluşturması yönünde büyük bir beklenti ortaya çıkmıştır. John Ioannidis: Proteomik te büyük ölçüde diğer omik teknolojilerinin (genomik, transkriptomik, gen ekspresyon profilinin belirlenmesi, metabolomik, farmakogenomik, vs.) izlediği yoldan geçmiştir. Bu alanlardaki gelişmelerin bireysel ve mutlak etkili bir tıp geliştirilmesine yol açacağı yönünde yapay bir beklenti oluşmuştur. Proteomikin önemli bir yönü, yirminci yüzyılda klinik uygulamaya giren, başarılı olan ya da başarılı gibi görünen biyolojik belirteçlerin çoğunun protein yapısında olmasıdır. Böylece tek bir protein ya da peptidin değil de, bütün proteomun ortaya konmasının tanı, prognoz ve önceden belirleme alanlarındaki yeteneğimizi geometrik olarak arttıracağı beklentisi oluşmuştur. Oysa gerçek bundan farklıdır. Mary Lopez: Fikirler ve kavramlar çok parlak görünmekle birlikte sorunlarla karşılaşılmıştır. Proteinleri analiz etmek genlerden çok daha zordur. Genomik alanında çok hızlı gelişmeler olduğundan proteomikin de arkadan takip edeceği düşünülmüştür. Teknolojinin fikirleri yakalamak için bir zamana gerek duyduğu doğrudur; ancak proteinleri doğru olarak saptamak ve ölçmek için duyarlı aletler geliştirecek yeteri kadar zaman geçmiştir. Gerek ulusal ya da uluslararası kurumlardan, gerekse özel kuruluşlardan klinik proteomiki geliştirmeye yönelik yeterince kaynak sağlanmış mıdır? Henri Rodriguez: Biyomedikal bir araştırmacı olarak ilgi alanım bilimsel bilginin hasta bakımına yansımasının sağlanmasıdır. Herkesin bildiği gibi bu bir zaman ve kaynak sorunudur. Büyük resime bakıldığında, maddi kaynaklar sadece klinik proteomik alanına ait bir sorun değildir. Biyomedikal araştırmaların tümü yetersiz maddi kaynak tehlikesi ile karşı karşıyadır. Yeni cihazlar ve teknolojilerin geliştirilmesi, proteomik ve genomik gibi omik tabanlı araştırmalardan elde edilen verilerin toplum erişmine açılması ve bu verilerden elde edilen bilgilerin genişletilebilmesi (biyoinformatik) gibi pek çok faktörün etkileşiminin söz konusu olduğu günümüzde bu durum daha da belirgindir. Çözüm hiç kolay değildir ve kısıtlı bütçelerle çalışmak kaçınılmazdır. Bence önemli olan büyük resmi görmekten, yani insan sağlığını iyileştirmeye yönelik yeni keşifler yapmaya çalışmaktan vazgeçmemektir. Andrew N. Hoofnagle: Bu soruyu yanıtlamadan önce “klinik proteomik” tanımının önemini anladığımızdan emin olmalıyız. Benim duyduğum ve kullandığım çok sayıda tanım var. Örnek olarak, (1) biyolojik bir numunede bir hastalıkla ilgili çok sayıda proteinin nicel olarak ölçülmesi; (2) biyolojik bir numunede bir hastalıkla ilgili proteinlerin belirlenmesi ve nisbi miktarlarının ölçülmesi; ve (3) sağlığa ilişkin iyileşmelere yol açacak deneyler yapmak üzere insan numunelerindeki proteinlerin nicel olarak ölçülmesi tanımlarını verebilirim. Bir klinik kimyacı olarak şüphesiz bunlar içinde en fazla ilgimi çeken üçüncü tanımdır. Ne yazık ki maddi kaynak bulması en zor olan alan da budur. Ne mutlu ki NIH tarafından desteklenen Klinik Proteomik Tümör Analiz Konsorsiyumu bu kısırdöngüyü kırmıştır. Programın önemli bir bölümü tümör biyolojisine aktarılmakla beraber, araştırmacılara yeni tetkik yöntem ve teknolojileri geliştirmek üzere hatırı sayılır bir kaynak sağlanmaktadır. Bu program yardımı ile geliştirilecek yeniliklerin klinik laboratuvarlarda uygulama alanı bulacağından umutluyum. Bu desteğin klinik proteomik açısından çok önemli olduğuna inanıyorum, ancak daha fazla destek sağlanmasının iyi olacağını düşünüyorum. John Ioannidis: Toplum için bilime ve araştırmaya yapılacak yatırımdan daha iyisinin olduğunu düşünmüyorum. Bu nedenle klinik proteomik araştırmalara sağlanacak maddi desteğin çok daha fazla olması gerektiğine inanıyorum. Ancak gerçekçi düşünmemiz gerekirse farklı araştırma alanlarına maddi destek sağlanması göz önüne alındığında bugüne kadar proteomik konusunda sağlanan desteğin hiç de az olmadığını kabul etmeliyiz. Ancak kaynakların daha verimli kullanılabileceğini söylemeliyim. Bugüne kadarki araştırmalarda geçiş konusu yeterince aydınlatılamamış ve klinik uygulama hedeflerine ulaşılamamıştır. Biyolojik belirteç geliştirme, geçerlilik, klinik kullanım ve uygulama alanlarında büyük ölçekli, çok merkezli çalışmalar için hala maddi desteğe ihtiyaç vardır. Klinik proteomik konusu sponsorların yeterince ilgisini çekmemektedir. Mary Lopez: Şüphesiz hiçbir zaman “yeterli” demek mümkün değildir. ABD’de bilim yapmanın maliyeti çok hızlı bir şekilde artarken NIH bütçesi sabit kalmaktadır. Bu da daha düşük maddi kaynak için daha fazla rekabet etme zorunluluğunu getirmektedir. Riskten kaçınma yaklaşımının bir yansıması olarak yenilikçi projelere ayrılan para azalmaktadır. Bardağın dolu tarafına baktığımızda ise bu durum akademik camia ile endüstri arasında bilimsel ilerlemelere zemin hazırlayacak daha yakın bir işbirliği doğmasına neden olmaktadır. Klinik proteomikin hedeflerine ulaşmasını engelleyen başlıca faktörler nelerdir? Henri Rodriguez: Biyomedikal araştırmalarda göz önünde bulundurulması gereken iki faktör vardır; bir hastalığın altında yatan mekanizmanın anlaşılması (temel bilimler) ve bunun hasta bakımına yansımasının öğrenilmesi (klinik bilimler). Proteomik son on yılda çok ciddi mesafe katetmiştir. Ancak veriler bağımsız laboratuvarlarca doğrulanana kadar belirteç geliştirme süreci sönük kalacaktır. Klinik proteomik alanında engel teşkil ettiği öne sürülen çok sayıda bariyer vardır ve Ulusal Kanser Enstitüsü Klinik Proteomik Tümör Analiz Konsorsiyumu gibi araştırma grupları bunları standardize etmek ve birbiriyle uyumlu hale getirmek için yoğun çaba harcamaktadır. Bu noktada belirlenen başlıklar arasında proteomik platformlar arasında veya içinde görülen teknolojik farklılıklar, biyolojik örneklerin elde edilmesindeki değişkenlikler, düzenleyici bilim, antikor kitleri (yenilenebilir), testler ve veri tabanlarının toplum erişimine açık olması, veri analiz araçlarının iyileştirilmesi, çalışma tasarımlarının uygun olması ve multidisipliner araştırma ekiplerinin katılımı sayılabilir. Proteomik klinik tanı alanına uygulanacaksa, her aşamanın evrensel düzeyde kabul edilen şekişlde ölçülebilmesi gerekir. Böylece gözlenen değişikliklerin yöntem farklılıklarını değil, biyolojik durumu yansıttığından emin olunabilir. Araştırmacılar, sponsorlar, Gıda ve İlaç Yönetimi (FDA), Medicare ve Medicaid Servisleri, klinisyenler ve klinik kimyacılar arasında iletişim ve işbirliği sağlanması çok önemlidir. Bu amaçla toplumun uzun vadeli desteği gereklidir. Benim düşünceme göre böylece beklentilerin karşılanması mümkün olacaktır. Andrew N. Hoofnagle: Tekrar söylüyorum, tanımlar önemlidir. Eğer beklenen tanı koyma, prognoz belirleme ve tedavi yönlendirmesi için yeni biyolojik belirteçlerin ortaya konması ise, başlıca engel en önemli klinik soruları soran iyi tasarlanmış çalışmalardır. Yeni bir biyolojik belirteç konusunda eksiklik yoktur. Ancak iyi tasarlanmış yeterli sayıda geçerlilik çalışması yapılmamıştır. Başka bir engel yeni belirteçlerle ilgili beklentilerdir. Örnek olarak prostata özgü antijen (PSA) verilebilir. PSA yıllarca birinci basamak hekimleri tarafından biyopsi için ürologa gönderme kriteri olarak kullanıulmıştır. Ancak bu testin prostat kanseri için özgünlüğünün düşük olduğu saptanmış ve yetkili makamlar tarafından taram testi olarak kullanılmaması önerilmiştir. Bir sonrakinin hangi test olacağı konusunda dikkatli davranmakta yarar vardır. Klinik proteomikten optimal olmayan bir panel yerine mükemmel bir süper belirteç yaratması bekleniyorsa, bağdaşma konusu da dikkate alınmalıdır. Bu alanda ileriye dönük klinik çalışma gerçekleştirebilmemiz maliyet ve lojistik sorunları engellenmektedir. Beklenti yeni klinik proteomik teknolojilerin kullanıldığı testler geliştirmekse, bu hedefe zaten ulaşılmıştır. John Ioannidis: En büyük engel beklentilerin fazla yüksek tutulmasıdır. Bu durum berrak düşünmeyi ve bu teknolojilerden ne gibi gerçekçi yararlar elde edeceğimizi anlamayı önlemektedir. Mükemmel tanı ve/veya ön belirleme imkanı sağlayacak testlerin geliştirilmesi mümkün olmayabilir, ancak doğruluk, etkinlik ve hız anlamında ılımlı ve klinik açıdan yararlı iyileştirmeler sağlanabilir. Beklentilerin çıtası bu düzeye indirildiğinde mevcut engeller arasında geniş ölçekli çalışmaların olmaması, standart ve rutin geçerlilik süreçlerinin bulunmaması ve araştırmacıların klinik uygulamaya yönelik proteomik çalışmaları yapmak hususundaki isteksizlikleri sayılabilir. Bu alandaki ilginin uyanması için tek ihtiyaç duyulan ilginç bir gözlemin iyi bir dergide yayınlanmasıdır. Mary Lopez: Günümüzde en önemli engel yeni biyolojik belirteçlerin rutin klinik uygulamaların içine alınmasıdır. Yeni biyolojik belirteçin güvenilir ve maliyet-etkin olduğu gösterildikten sonra klinik kullanıma geçişi hızlanacaktır. Testlerin maliyetlerini düşürmeye yönelik yeni girişimlere ihtiyaç vardır. Mevcut klinik testlerde proteomikler tarafından doldurulabilecek boşluklar nelerdir? Henry Rodriguez: Konvansiyonel immün tetkiklerin eksik yönleri maliyetlerinin yüksek olması, antikorlar kullanılarak nitelikli sonuçlar elde edilmek istendiğinde uzun bir süreye ihtiyaç duyulması ve çoğullamanın sınırlılılığıdır. Sağlık ve/veya hastalık durumlarının incelenmesi için bir test paneline ihtiyaç duyulduğunun farkedilmesi klinik toplumu ileriye dönük çoğullanabilecek nicel yaklaşımlar geliştirme zorunluluğu konusunda uyarmıştır. Klinik proteomiklerin dolduracağı boşluk budur. Deneysel çalışmalarda biyolojik belirteç adayı 1000’den fazla ürün geliştirilmiş, ancak ne yazık ki bunların çoğu klinik kullanıma girmemiştir. Bu boşluğu kapatmak için laboratuvarlar çok sayıda tepkime izleme (MRM) şeklinde adlandırılan bir süreç geliştirmiştir. Bu süreçte biyolojik belirteç adayı geliştirildikten sonra duyarlık ve özgünlüğünü değerlendirerek geçerliliğinin belirlenmesi hedeflenmektedir. MRM bulgularının 2009 yılında farklı laboratuvarlarda ve platformlarda tekrarlanabilirliğinin gösterilmesi bir dönüm noktası olmuştur. Günümüzde hangi immün antikor testlerinin yapıldığı ile ilgili bir kataloga bakıldığında listenin çok sınırlı olduğu görülür. Ancak MRM aracılığı ile doğrulama yapıldığında bu sorun ekonomik ve bilimsel kapsamda çözülür. Böylece hangi adayların pahalı ve zaman alıcı klinik geçerlilik çalışmalarına tabi tutulacağı ayırt edilir ve diyagnostik geliştirme çabaları daha verimli bir hale gelir. Son MRM çalışmalarında 150 kite kadar çoğullama yapılabileceği gösterilmiştir. MRM öncesinde immün zenginleştirme yapıldığı takdirde bu yaklaşımın duyarlılığı dramatik şekilde artmaktadır. Andrew N. Hoofnagle: Mevcut klinik testlerde (1) özgünlüğün bulunmaması, (2) etkileşen maddeler olması, (3) yüksek konsantrasyonlarda yanlış sonuçlar elde edilmesi ve (4) farklı platformlar arasında bağdaşım olmaması gibi sorunlar vardır. Klinik proteomik yeni proteomik teknolojilerin klinik numunelere uygulanması şeklinde tanımlanırsa teknolojik perspektiften pek çok sorunun üstesinden gelindiğini söyleyebiliriz. Eğer (1) insan durumu geçiş sonrası modifikasyona uğramış proteinlerin aktivitelerinin bütünlüğü ve dizilimi şeklinde tanımlanırsa, (2) insan durumu klinik proteomik yöntemlerce tarif edilebiliyorsa, ve (3) hastalık klinik proteomik tarafından belirlenen bir durum olarak tanımlanırsa, klinik proteomikin uygun numunelerde çok sayıda proteinin incelenmesine olanak sağlayarak bu boşluğu doldurması mümkündür. En azından umut edilen durum budur ve şu anda incelenme aşamasındadır. John Ioannidis: Proteomik ya da tanı ve ön belirleme alanında devrim yaratacak yeni bir teknoloji için en önemli sorun günlük uygulamada kullanılan yöntemler hakkında bildiklerimiz ve bilmediklerimizle ilişkili sistematik bir yaklaşımımızın olmamasıdır. Tıbbi literatürde tanısal testlerle ilişkili yalnızca birkaç yüz randomize çalışma vardır ki bu sayı ilaçlarla ilgili olanlardan 200 kat daha azdır. Bir testin klinikte başarılı olması için yüksek tanısal performansa, yani özgünlük ve duyarlılığa sahip olması gerektiği defalarca gösterilmiştir, ancak bu durum tek başına yeterli değildir. Özgünlüğü ve duyarlılığı yüksek olan pek çok testin klinik yararı yoktur; maliyetleri arttırmak, hatta tıbbi bakıma zarar vermekten başka bir işe yaramazlar. Tanısal kanıtların bir haritasını oluşturmak ve farklı hastalıklar ya da durumlarla ilgili ne tür boşluklarımız bulunduğunu anlamak için sistematik bir çaba gösterilmesi gereklidir. Dahası, belli performansa sahip olan yeni özgün tanı ya da önceden belirleme testleri geliştirmenin farklı endikasyonlar ya da durumlarda yarar sağlayıp sağlamayacağını değerlendirmek için simülasyon modelleri kullanılabilir. Korkarım ki, kaynakların önemli bir bölümü hastaya ya da maliyetlere olumlu etki göstermeyecek, dolayısıyla klinikte kullanılmayacak, ancak analitik açıdan gerçekten mükemmel yeni tetkik yöntemleri geliştirmek için harcanmaktadır. Mary Lopez: Genelde en önemli boşluk seçicilik alanı doğrudan bağlantılıdır. Altın standart immünolojik testler veya ELISA olduğundan, yalancı pozitif sonuç verme oranı yüksek bir ELISA testi iyileştirme hedeflerinden biridir. Bu duruma iyi bilinen bir örnek PSA testidir. PSA çok farklı formlarda bulunabileceğinden standart ELISA ile iyi bir seçicilik düzeyi elde etmek neredeyse imkansızdır. Klinik açıdan anlamlı izoformların miktarının doğru olarak ölçülmesi ve yalancı pozitiflik oranının düşürülmesi için sıralama seviyesindeki değişkenliklerin belirlenebilmesi gereklidir. Standart immünolojik testlerin ötesine geçmeye hazır mıyız ve hazırsak neden? Henry Rodriguez: İmmünolojik testlerin bu noktada kalmasını söylemek güvenli olmakla birlikte, sınırlılıkları aşmak üzere MS-temelli tetkiklerin kullanılacağı özel durumlar vardır ve yenileri de olacaktır. İmmünolojik testler klinik laboratuvarlarda proteinleri tetkik etmek üzere en yaygın kullanılan tekniklerdir ve FDA bu alanda gerekli düzenlemeleri oluşturacak deneyime ve bilimsel kanıta sahiptir. Dahası tetkik başına maliyet, yatırım düzeyi ve personel gereksinimi gibi ekonomik boyutlar da iyi bilinmektedir. Mevcut immünolojik testlerin yerine yenilerinin kullanılması için alet ve yöntemin geçerliliğinin FDA tarafından onaylanması gerekli ise de, teknik ya da ekonomik nedenlerle MS-temelli bir yönteme geçilmesinin zorunlu olduğu durumlar olacaktır. Bilimsel açıdan MRM kullanılarak peptidlerin miktarının ölçülmesi mutantlar, bütünleşik varyantlar ve geçiş sonrası farklılıklar için geleneksel immünolojik testlere tercih edilir. Çünkü proteinin birincil yapısındaki değişikliklere özgü antikorları oluşturmak güçtür. Teknik nedenlere bir örnek olarak tiroglobülin verilebilir. Toplumun %20’sinde otoantikorlar standart immünolojik testleri etkileyerek yalancı negatif sonuçlar elde edilmesine neden olur. Otoantikor etkileşimini aşmak üzere Hoofnagle ve arkadaşları ARUP Laboratories ve Quest Diagnostics için bir peptid-immüno-MRM MS testi geliştirmiştir (Clinical Chemistry, 2008; 54; 1796-1804 ve 2013; 59; 982-990). Ekonomik açıdan bakıldığında çoklu çalışma kapasitesi ve otomatizasyon nedeniyle kitle spektrometrisinin test başına maliyeti düşürmesi beklenmektedir. Bu da klinik laboratuvarlara girişinin önündeki en büyük engeli ortadan kaldıracaktır. MS platformlarının analitik geçerliğini kolaylaştırmak üzere akademik araştırmacılar, ilaç endüstrisi ve FDA ile Ulusal Kanser Enstitüsü çoklu testlerin etkinlik ve güvenilirliğinin değerlendirilme esaslarını yayınlamıştır (Clinical Chemistry, 2010; 56; 165171). Andrew N. Hoofnagle: Evet, hazırız. İmmünolojik testler özellikle insan numuneleri söz konusu olduğunda sorun yaratabilen bir kategoridir. Klinik proteomik alanında güvenilir kalibrasyon, numune hazırlama ve analiz yöntemleri belirleme üzerine önemli bir zaman harcanmış ve klinik biyokimyacılar teknolojiyi hasta bakımına uyarlama pozisyonuna itilmiştir. Başarıya ulaşmak için mahir laboratuvar teknojistlerine ihtiyaç yoktur. Referans laboratuvarları klinik proteomik teknolojilerinin gücünden zaten yararlanmaktadır ve diğer klinik laboratuvarların da en kısa zamanda bu gücü kullanmaya başlayacağına inancım tamdır. John Ioannidis: Teknoloji açısından baktığımızda prensip olarak evet. Ancak standart immünolojik tetkikler, eğer yeteri kadar doğru sonuç veriyorsa, pek çok durumda tercih edilebilir. Çünkü daha düşük maliyetle, pek çok laboratuvar tarafından gerçekleştirilebilir. Daha yeni ve daha karmaşık bir yöntemin daha iyi olması şart değildir. Mary Lopez: Evet. Standart immünolojik tekniklerin yukarıda belirtilen yalancı pozitif sonuç verme gibi bazı olumsuz yanları bulunmaktadır. Bu durum yakalama antikorunun özgün olmamasından, hedef moleküllerin heterojenitesinden, ya da her ikisinden kaynaklanıyor olabilir. Proteinlerin çoğu budanma, geçiş sonrası değişiklikler veya tek nükleotid polimorfizmi gibi nedenlerle çoklu formlar halinde görülür. Hastalıklarla ilgili proteinlerin çoğu aktif ve inaktif formlarda bulunabilir ve yakalama antikorları tarafından ayırt edilmeksizin tutulur. Dolayısıyla, hastalıklarla ilgili formların sıralama düzeyinde saptanması gereklidir. Bu özgünlük düşük düzeylerdeki hedefleri zenginleştirmek üzere antikorlar kullanıldığında bile MS tarafından sağlanabilir. Bir sonraki aşama kitle spektrometrisi midir? Henry Rodriguez: Bir test hasta bakımı açısından yararlı olmasının dışında doğru, güvenilir, otomatize, kolay uygulanır ve maliyet açısından uygunsa klinikte kendine yer bulur. MS birçok bilimsel alanda öncü bir rol oynamaktadır ve uzun zamandır halk sağlığı laboratuvarlarında standart olarak kullanılmaktadır. Benim açımdan soru bir sonraki aşamanın kitle spektrometrisi olup olmadığı değil, ne zaman protein analizleri için immünolojik testlerin yerine kullanılmak üzere uyarlanacağıdır. Yeterli biyolojik belirteç bulunmamasına rağmen bu uyarlama sürecinde teknik bir engel yoktur ve yalnızca bir mühendislik sorunu söz konusudur. Kitle spektrometrisinin tüm klinik laboratuvarlarda kullanılması biraz zaman alacaktır, ancak Clinical Chemistry gibi dergilerde yer alan yayınlardan ve gerek internet üzerinden verilen eğitimlerden, gerekse düzenlenen seminerlerden anlaşıldığı üzere profesyonellerin ilgisinin artması, yakın bir gelecekte yaygın uygulamaya gireceği izlenimini uyandırmaktadır. Burada gözden uzak tutulmaması gereken nokta kitle spektrometrisinin immünolojik testlerin yerine değil, teknolojik avantajlarıyla belli durumlarda tamamlayıcısı olarak kullanılmasıdır. Andrew N. Hoofnagle: Şu andaki durum zaten budur. Artık kalibrasyon materyallerinin, güvenilir kitlerin, duyarlı kalite kontrol süreçlerinin ve eğitimli personelin oluşturulmasına sıra gelmiştir. John Ioannidis: Burada daha çok lokal parametreler etkindir: rutin testleri uygulayan hangi laboratuvarlar doğru bir şekilde MS uygulaması yapabilecektir, maliyet ve eğitim sorunları nasıl aşılacaktır, kliniğe kolay bilgi akışı sağlanabilecek midir? Bu sorular geç dönem (evre 3 ve 4) geçiş çalışmalarının tamamlanması ile yanıtlanabilecektir. Bugüne kadar proteomik alanında bu tür araştırmalar pek ilgi çekmemiştir. Mary Lopez: MS klinik tetkik platformlarında bugün için bir devrimdir ve gelecekte de öyle olmaya devam edecektir. MS özgünlük alanında kritik bir ihtiyacı karşılar. Tüm testleri MS platformlarına kaydırılmasına gerek olmayabilir,ancak immünolojik testlerin yetersiz kaldığı durumlarda MS şüphesiz ki boşluğu dolduracaktır. Klinikte proteomik ile ilgili bildiğiniz başarılı uygulama örnekleri var mı? Mikrobik enfeksiyonların tanısı bir örnek teşkil edebilir mi? Henry Rodriguez: Bu soruyu Staphylococcus aureus enfeksiyonu tanısı klinik proteomik yardımı ile konmuş bir hastaya sorarsanız alacağınız yanıt EVET olacaktır. Klinik MS sistemlerinin bakterilerin ve mayaların hızla belirlenmesi için FDA tarafından onaylanması gelecekteki klinik proteomik uygulamaları için umut vaat eden bir gelişme olmuştur. Klinik proteomik bir hastalığın moleküler mekanizmasının daha iyi anlaşılmasını, dolayısıyla da hastaya en iyi tıbbi yaklaşımın verilmesini sağlayan bir araç olarak kabul edilmelidir. Tedavi alanında bir fark yaratacağı düşüncesindeyim. Tedavi ajanları gittikçe belli hasta gruplarını hedef almaktadır ve bu gruplardaki yararın gösterilmesi yönünde beklentiler ortaya çıkmıştır. Bu durum onkoloji alanında özellikle belirgindir; tedavi yanıtının önceden belirlenmesini sağlayan özgün biyolojik belirteçleri taşıyan hastaların saptanmasına ihtiyaç vardır. Tedaviye yanıt vermeyecek hastalarda yarar sağlayabilecek başka tedavilere hızla geçilmesi sağlanabilir. Bu tür tetkikler arasında FISH (floresan in situ hibriizasyon), immünhistokimya, PCR ve DNA/RNA sonraki nesil sıralama sayılabilir. Geliştirilme aşamasında olan ilaçların yaklaşık 1/3’ü bir genomik ya da proteomik belirteçle ilişkilidir. Bu oran son iki yılda yaklaşık %50 düzeyinde yükselmiştir. İlaç endüstrisinde faz 1 aşamasını geçemeyen yeni ürün oranının %92 gibi göz korkutucu bir düzeyde olması göz önüne alındığında, klinik çalışmalarda proteomik teknikleri ile belirlenen bazı belirteçlerin kullanılması hem daha doğru kararlar verilmesini, hem daha akılcı yatırımlar yapılmasını, hem de daha hedefe yönelik ilaçlar geliştirilmesini sağlayacaktır. Andrew N. Hoofnagle: Klinik laboratuvarda MALDI-TOF MS kullanılarak bakteri ve mayaların belirlenmesi kitle spektrometrisinin klinik kullanımı açısından büyük bir adım olmuştur. Ancak MALDI-TOF kullanılarak bakterilerin belirlenmesini sağlamak klinik proteomikin alanına girer mi konusu tartışmalıdır. Numunelerde bazı küçük proteinlerin yakalandığı doğrudur, ancak süreç daha çok kitle spektrometrisidir. Spektrumda protein ve lipidlerin de belirlenmesi işlemin başarısının zirvesi değildir. Bu nedenle ben MALDI-TOF için bir proteomik platformu değil, bakteri belirleme yöntemi ifadesini tercih ediyorum. İki bakteri türü arasındaki farkı belirlemek, havadaki bir balondan bakarak Büyük Kanyon’un iki yakasının arasındaki farkı söylemek gibidir. MALDI-TOF kitle spektrometrileri henüz önemli sonuçlara yol açabilen pek çok bakteri türünü ayırt etmekten uzaktır. Dahası evre 1 over kanserli kadınlarla normal kontroller arasındaki fark çok küçüktür ve MALDI-TOF MS ile bu farkı belirleyebilmek çok zordur. John Ioannidis: Bu yaklaşımım nedeniyle kötümser olarak damgalanmayı göze alıyorum, ancak bence bugüne kadar klinik proteomik alanında önemli bir başarı sağlandığını söylemek mümkün değil. Proteomik teknolojisinin uygulanmasının hastalarda olumlu sonuçlar sağladığını gösteren büyük ölçekli, randomize çalışmalarda elde edilmiş bir veri yok. Önceleri MALDI-TOF MS kullanılarak bakteriyel enfeksiyonlarla ilgili elde edilen veriler oldukça umut verici bulunmuş ve pek çok hastane ile laboratuvar bu tekniği kullanmaya başlamıştır. Ancak erken tanı koymanın klinik anlamda bize ne kazandırdığını görmemizi sağlayacak randomize çalışmalar henüz yapılmamıştır. Örneğin, geleneksel yöntemlerden 24 saat önce bir bakterinin saptanması, henüz antibiyotik duyarlık sonucu bilinmese bile, çok değerli bir bilgi gibi görünmektedir. Ancak bu erken bilginin hastanede kalış süresi, antibiyotik tedavisine bağlı veya genel istenmeyen olaylar, tedavi başarısı gibi orta vadeli veya ölüm ya da önemli klinik olaylar gibi ciddi sonuçlar üzerine nasıl bir yarar sağladığı bilinmemektedir. Bu soruların yanıtlanması için randomize klinik çalışmalara gereksinim vardır. Erken tanıya yönelik pek çok farklı teknoloji söz konusu olduğundan, bu yöntemlerin birbiriyle karşılaştırılacağı çalışmalar yapılmalıdır. Mary Lopez: Çarpıcı bir örnek amiloidoz tanısıdır. Mayo Kliniği’ndeki bir grup araştırmacı 2009 yılında duyarlığı ve özgünlüğü histopatolojik yöntemden daha fazla olan MS tabanlı bir tetkik yöntemi geliştirmiştir. İlk geliştirme sürecinden sonra test yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır, çünkü histopatolojik incelemede alt tipleme yapılmasını engelleyen yoğun zemin boyanması sorununu aşmak mümkün olmuştur. Klinik proteomik uygulamalarının daha yaygınlaşmasını sağlayacak gelişmeler bekliyor musunuz? Henry Rodriguez: Akla gelen iki temel alan analitik gelişmeler (yazılım ve donanım) ve klinik genomiğin proteomikle eşleştirilmesidir. MS teknolojisi kullanılarak mikrobiyal tanı sağlayan iki (Bio-Mérieux ve Bruker) ve viral tanı sağlayan bir (BioArray Solutions) testin FDA tarafından onaylanması yarının klinik laboratuvarları için bir mihenk taşıdır. MS platformlarının çoklu immünoafinitesi (Clinical Chemistry, 2010; 56; 237-243), immüno-MRM MS testleri, standardizasyon ve antikor nitelikleri gibi bilgiler yakın gelecekte bu platformları kullanan klinik laboratuvarların erişimine açık hale gelecektir. Hedefe yönelik MS temelli proteomik yaklaşımların iyileştirilmesi (otomatizasyondan veri elde etmeye kadar) ve daha düşük yükle daha yüksek özgünlük düzeyine erişme beklenebilir. Genomik alanındaki araştırmacılar multipleks DNA kullanmaktadır; bunun proteomikteki yansıması hedefe yönelik multipleks proteomik olabilir. Henüz araştırma aşamasında olan tek hücre proteomiki (CyTOF kitle sitometri), MagARRAY (manyetik multipleks protein dizilim) ve NAPPA (nükleik asit programlanabilir protein dizilimi) gibi yeni teknolojiler bütün laboratuvarlar tarafından kullanılabilir hale gelebilir. Henüz araştırma aşamasında olan genomiğin proteomike yansıması konusunda ise çok büyük potansiyel olduğunu düşünüyorum. Klinik bir perspektiften bakarsak sonraki nesil sıralamasından elde edilen bilgi terapötik girişimler sınırlı olduğundan her endikasyonda yarar sağlamayacaktır. Sonraki nesil sıralamasının sağlayacağı veri bütüncül klinik perspektife bir katkıda bulunmayacaktır. Bu durumda proteomik gibi başka yöntemler daha çok önem kazanacaktır. Genotipik belirteçler, proteomik belirteçler ve hastalıklar arasındaki bağlantının daha iyi anlaşılması ile hasta açısından yarar sağlayacak “proteogenomik” testler geliştirilebilecektir. Andrew N. Hoofnagle: MS öncesinde proteinlerin veya triptik peptidlerin zenginleştirilmesi proteomik teknolojisindeki başarılı geçiş açısından çok önemli olacaktır. Kitlerin de geliştirilmesine ihtiyaç vardır. John Ioannidis: Klinik proteomik uygulamalarının artması için teknolojik gelişmelerin gerekli olduğu düşüncesindeyim. Faz 0 ve 1 araştırmalar ile ilgili on binlerce sayfa yayın var. Gerçek hayattaki ihtiyacımız ise uygulamada en iyi olması beklenen aday tekniklerin test edilmesidir. Mary Lopez: Kitle spektrometri cihazlarının duyarlık ve çözünürlüklerinin artması ile beraber numune hazırlama yöntemlerinin daha etkili hale gelmesi daha düşük konsantrasyonlardaki hastalık belirteçlerinin ölçülebilmesini sağlamıştır. Bu yöntemler otomasyon ve verimlilik açısından optimize edildikten sonra yüksek özgünlükleri nedeniyle rutin uygulamaya daha yüksek oranda girecektir. On yıl sonra klinik proteomikin tıbbi uygulamalarda yer alacağını düşünüyor musunuz? Henry Rodriguez: Kesinlikle. İmmünolojik testler 1960’larda küçük moleküllerin ölçülmesi amacıyla kullanılıyordu. Bu testlerin yerine MS ve protein/antikor dizilim tetkiklerinin geçmesi ve bugün dünyada yılda milyonlarca testin yapılıyor olması, kullanımlarının daha büyük moleküllerin (proteinler) belirlenmesi yönünde gelişeceğini öngörmemizi sağlamıştır. Ancak günümüzdeki yüksek maliyetler ve yetersiz bilgili personel sayısı bir engel olarak kabul edilebilir. Şahsen teknolojinin ne getireceğini bilemem. Bir multipleks MS ya da protein/antikor dizilim cihazının hızlı, doğru ve makul bir maliyetle sonuç vereceğini umuyorum. İleriye doğru bakarken, yeni teknolojileri pazara sunmadan ve yeni biyolojik belirteçler keşfetmeden önce arada bir duraklayıp proteogenomik çalışmalardan elde ettiğimiz bilgileri gözden geçirmemizde yarar olduğunu düşünüyorum. İlaç endüstrisi ile karşılaştırma yaptığımızda, bir ilacı pazara sunmak için yaklaşık bir milyar dolarlık bir bütçeye ve 10-15 yıllık bir zaman dilimine gerek duyulduğunu görürüz. Başarısızlık oranları ve enflasyon da hesaba katıldığında bu maliyet 4-11 milyar dolar düzeyine yükselmektedir. Bu rakamlar değişken olmakla birlikte dudak uçuklatıcıdır. Klinik proteomik konusunda arada bir duraklama gereği olmasının nedenleri arasında başlangıçtaki beklentilerin çok yüksek tutulması da vardır. Transkriptomik gibi başka alanlara baktığımızda klinik uygulamaya girmiş pek çok test olduğunu görüyoruz. Toplum olarak araştırmacıları, klinisyenleri, laboratuvarcıları ve hasta avukatlarını cesaretlendirmek için beklentileri daha gerçekçi tutmalıyız. Böyle bir ortak görüş klinik proteomik alanında gelişmelerin önünü açacaktır. Yeni teknolojiler geliştirilmesi ve biyolojik temelin daha iyi anlaşılması hastalar açısından daha büyük yararlar sağlayacaktır düşüncesindeyim. Andrew N. Hoofnagle: Evet: tanı, prognoz ve tedavi açısından daha özgün yöntemlere ihtiyaç duyan belli hastalarda kitle spektrometrisi immünolojik testlerin yerini alacaktır. John Ioannidis: Gelecek 10 yılda çok spektaküler bir gelişme olacağını sanmıyorum. Ancak MS ya da diğer proteomik tetkiklerin bazı endikasyonlar üzerine yoğunlaşarak doğru ve erken tanı konusunda hasta lehine bazı yararlar sağlayabileceğini düşünüyorum. Yaygın bazı hastalıkların gelişme olasılığının ya da tedavi yanıtlarının öngörülmesi açısından gelişme sağlanabileceği konusunda daha az kötümserim. Geçiş sürecinde ilerleme sağlamak için işbirliği içinde ve iyi tasarlanmış geç dönem çalışmalarını desteklemeliyiz. Aksi halde 10 yıl sonra birkaç yüz bin sayfa daha yayınla hala başlıca bir uygulamanın bulunmadığı aynı noktada olabiliriz. Mary Lopez: Hastalık ile ilişkili protein belirteçleri ve panellerin rutin ölçümünü sağlayan klinik analiz cihazlarının ortaya çıkması mümkündür. Özgün biyolojik belirteçlerin otomatik ve rutin olarak ölçülmesi tıbbın daha kişiselleştirilmesine olanak sağlayabilir. Bu teknoloji klinik açıdan önemli protein izoformları ve varyantları hakkında bilgi sağlaması mümkün olmayan genomik testleri de daha yararlı hale getirebilir. Yazar Katkıları: Tüm yazarlar bu makalenin bilimsel içeriğine katkıda bulunduklarını ve şu üç gereksinimi yerine getirdiklerini ifade eder: (a) kavram ve tasarıma, verilerin toplanmasına veya analiz edilmesi ve yorumlanmasına anlamlı katkı; (b) makalenin bilimsel içerik açısından hazırlanması ve gözden geçirilmesi; ve (c) yayımlanma için nihai onay. Yazarların Olası Çıkar Çatışması Beyanları: Makalenin gönderilmesi aşamasında tüm yazarlar Olası Çıkar Çatışması Beyan Formu’nu doldurmuştur. Olası çıkar çatışmaları: İstihdam veya Yöneticilik: E. P. Diamandis, Clinical Chemistry, AACC; A. N. Hoofnagle, Clinical Chemistry, AACC Danışmanlık: Bildirilmemiştir. Hissedarlık: Bildirilmemiştir. Onursal Ücretler: Bildirilmemiştir. Araştırma Desteği: A. N. Hoofnagle, Waters tarafından Washington Üniversitesi’ne kurumsal bağış, Thermo tarafından Washington Üniversitesi’ne kurumsal bağış. Uzman Tanıklığı: Bildirilmemiştir. Patentler: A. N. Hoofnagle, ABD patent numarası 7,807,172.