İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp SUŞLARININ PROBİYOTİK
Transkript
İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp SUŞLARININ PROBİYOTİK
T.C. AHİ EVRAN ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp SUŞLARININ PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ Selçuk ZORAL YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI KIRŞEHİR 2013 T.C. AHİ EVRAN ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İNSAN KAYNAKLI Lactobacillus Spp. SUŞLARININ PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ Selçuk ZORAL YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI DANIŞMAN Doç. Dr. Ergin KARİPTAŞ KIRŞEHİR EYLÜL 2013 Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü’ne Bu çalışma jürimiz tarafından BİYOLOJİ Anabilim Dalında YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Başkan: Doç. Dr. Kamil IŞIK………….. Üye: Doç. Dr. Ergin KARİPTAŞ…………. Üye: Yrd. Doç. Dr. Belgin ERDEM………… Onay Yukarıdaki imzaların, adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım. …/…/20.. Doç. Dr. Mahmut YILMAZ Enstitü Müdürü ÖZET Bu çalışmada, Kırşehir Devlet Hastanesine belirli bir şikayetle başvurmuş 25-50 yaş arası sindirim sistemi problemi bulunmayan 48 hastanın gaitasından izole edilmiş Lactobacillus spp. suşları kullanılmıştır. Toplam 25 adet olan bu suşların düşük pH dirençlerinin belirlenmesi, yüksek safra tuzu (oxgall) konsantrasyonlarına karşı toleransı ve safra tuzu (kolik asit) hidrolizi, bazı patojen mikroorganizmalara karşı inhibitör etkileri, antimikrobiyal aktiviteleri ve kolesterol asimilasyonunun belirlenmesi hedeflenmiştir. Değişik pH koşullarında (2.0, 2.5 ve 3.0) asitliğe en dirençli suşlar L. fermentum1 LS-5, L. fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 ve L. fermentum2 LS-25 olarak tespit edilmiştir. Yüksek safra tuzu konsantrasyonlarında (%0.3, %0.5, %1.0 ve % 1.5) L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 suşları canlılığını koruyabilmiştir. Ayıca safra tuzu (kolik asit) hidrolizi çalışmasında genel olarak iyi sonuçlar elde edilmiş, en yüksek değerleri ise L. pentosus LS-2 suşunda gözlemlenmiştir. Bu suşların antimikrobiyal aktivitelerinin tespiti için yapılan çalışmada 13 farklı antibiyogram diski denenmiş, suşların genelinin antibiyotiklere karşı duyarlı oldukları gözlemlenmiştir. Lactobacillus suşlarının patojen mikroorganizmalar üzerine inhibitör etkilerinin tespiti üzerine E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656), S. epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria sp. patojenleri ile bir çalışma yapılmıştır. Lactobacillus suşları genel olarak patojenlere karşı inhibitör etki göstermişlerdir. Ayrıca Lactobacillus suşlarının laktik asit dışında ürettiği antimikrobiyal maddelerin inhibitör etkisinin belirlenmesi üzerine yapılan bir başka çalışmada ise pH’sı yükseltilmiş süpernatantların patojenler üzerine etkisi gözlemlenmemiştir. Kolesterol asimilasyonunun belirlenmesi için yapılan çalışmada ise düşük asitliğe ve yüksek safra tuzuna dayanıklı, safra tuzu aktivitesi yüksek, antagositik etkiye sahip 5 suş L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12 ve L. fermentum2 LS-15 seçilmiş ve kolesterol giderimi çalışılmıştır. Kültürler MRS sıvı besi yerinde 10-22 µg/ml, %0.3’lük yüksek i safra tuzlu MRS sıvı besi yerinde 14-50 µg/ml, %0.3’lük kolik asitli MRS sıvı besi yerinde 8-13.5 µg/ml ve %0.3’lük taurocholic asit’li MRS sıvı besi yerinde 15-55 µg/ml kolesterol asimilasyonu yapmıştır. ii ABSTRACT Lactobacillus spp. strains isolated from the stool of 48 patients between the ages of 25 and 50 who resorted to the Kırşehir state hospital with various complaints without having a problem with their digestive system, were used in this study. The aim targeted was the designation of the low pH resistance, the tolerance against concentrations of high bile salt (oxgall) and the hydrolysis of bile salt (cholic acid), the inhibitory affects on some pathogen microorganisms, the designation of antimicrobial activity and cholesterol assimilation of all strains of which there were a total of 25. It has been found that the most resistant strains towards acidity under various pH conditions were L. fermentum1 LS-5, L. fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 and L. fermentum2 LS25. Strains L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS11, L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 were able to maintain their vitality in high concentrations of bile salt. Furthermore pleasing results were obtained from the bile salt hydrolysis study in general and the highest values were observed in the L. pentosus LS-2 strain. In the study which was conducted in order to estimate the antimicrobial activity of these strains, 13 different antibiogram disks were tried and it was observed that overall the strains were sensitive to antibiotics. A study was conducted with E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) and Neisseria sp. pathogens on the estimation of the inhibitory effects of Lactobacillus strains on pathogen microorganisms. Overall the Lactobacillus strains displayed an inhibitory effect on the pathogens. Furthermore the effect of supernatants with an increased pH on pathogens was observed in a different study concerning the estimation of the inhibitory effects of Lactobacillus strains on antimicrobial substances it produces other than lactic acid. And in the study which was conducted in order to estimate the cholesterol assimilation 5 strains L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12 and L. fermentum2 LS-15 which have low acidity, are resistant to high bile salt, have a high bile salt activity and have an antagositic effect were chosen and removal of cholesterol was studied. The cultures made cholesterol assimilation of iii 10-22 µg/ml in the MRS liquid feedlot, of 14-50 µg/ml in the MRS liquid feedlot with 0.3 %, of 8-13.5 µg/ml in the MRS liquid feed lot with 0.3 % cholic acid and of 15-55 µg/ml in the MRS liquid feedlot with 0.3 % taurocholic acid. iv TEŞEKKÜR Çalışmam boyunca yardımlarını benden esirgemeyen değerli danışman hocam Doç. Dr. Ergin KARİPTAŞ’a ve değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Belgin ERDEM’e, laboratuvar çalışmalarımda bana her zaman yardımcı olan hocam Arş. Gör. Tayfun KAYA ve hocam Dr. Şener TULUMOĞLU’na, örnek toplamamda bana her konuda yardımcı olan Kırşehir Devlet Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı çalışanlarına, her zaman yanımda olan dostluklarını ve yardımlarını benden esirgemeyen arkadaşlarıma, hayatım boyunca beni yalnız bırakmayan maddi-manevi destekleyen ve moral veren aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. v İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET...................................................................................................................................i ABSTRACT..................................................................................................................... iii TEŞEKKÜR.......................................................................................................................v İÇİNDEKİLER .................................................................................................................vi TABLOLAR DİZİNİ ........................................................................................................ix ŞEKİLLER DİZİNİ............................................................................................................x RESİMLER DİZİNİ..........................................................................................................xi SİMGELER VE KISALTMALAR................................................................................. xii 1. GİRİŞ .............................................................................................................................1 2. TEORİK ALT YAPI ......................................................................................................4 2.1. PROBİYOTİKLER .................................................................................................4 2.1.1. Probiyotiklerin Tanımı ve Tarihçesi ................................................................4 2.1.2. Probiyotik Olarak Kullanılan Mikroorganizmalar ...........................................5 2.1.3. Probiyotik Mikroorganizmalarda Aranan Özellikleri ......................................6 2.1.4. Probiyotiklerin Etki Mekanizması ...................................................................7 2.1.5. Probiyotiklerin Sağlık Üzerine Etkileri............................................................8 2.1.6. Probiyotiklerin Yan Etkileri ...........................................................................10 2.1.7. Probiyotik Ürünler ve Ticari Önemleri ..........................................................11 2.2. PREBİYOTİKLER ve SİNBİYOTİKLER............................................................11 2.2.1. Prebiyotikler...................................................................................................11 2.2.2. Sinbiyotikler...................................................................................................12 2.3. Lactobacillus CİNSİNE AİT BAKTERİLERİN ÖZELLİKLERİ ........................12 2.3.1 Lactobacillus Türlerinin Ürettikleri Antimikrobiyal Maddeler ......................15 2.3.1.1. Laktik asit................................................................................................15 vi 2.3.1.2. Hidrojen peroksit (H2O2) ........................................................................17 2.3.1.3. Bakteriosin ..............................................................................................17 2.4. BAĞIRSAK MİKROFLORASI............................................................................18 2.5. ANTAGONOSTİK ETKİDE KULLANİLAN MİKROORGANİZMALAR ......19 2.5.1. Escherichia coli..............................................................................................20 2.5.2. Staphylococcus epidermidis ...........................................................................20 2.5.3. Neisseria sp. ...................................................................................................21 2.5.4. Klebsiella pneumoniae ...................................................................................21 2.5.5. Pseudomonas aeruginosa ..............................................................................22 3. MATERYAL VE METOD ..........................................................................................23 3.1. MATERYAL.........................................................................................................23 3.1.1. Materyal Örnekleri .........................................................................................23 3.1.2. Bakterilerin Aktifleştirilmesi ve Gelişme Ortamları......................................23 3.1.3. Çalışmalarda Kullanılan Besiyerleri ..............................................................24 3.2.METOD..................................................................................................................28 3.2.1. İzolatların İzolasyonu ve İdendifikasyonu .....................................................28 3.2.2. Lactobacillus spp. Suşlarının Muhafazası......................................................28 3.2.3. Patojen Suşların Aktifleştirilmesi ve Muhafazası ..........................................29 3.2.4. Asit Dirençliliğinin Belirlenmesi ...................................................................29 3.2.5. Yüksek Safra Tuzu (Oxgall) Konsantrasyonlarına Dirençliliğin Belirlenmesi ..................................................................................................................................29 3.2.6. Safra Tuzu (Kolik Asit) Hidrolizinin Belirlenmesi........................................30 3.2.7. Antimikrobiyal Aktivitenin Belirlenmesi ......................................................30 3.2.8. Bazı Patojen Mikroorganizmalara Karşı Antagonostik Etkilerin Belirlenmesi ..................................................................................................................................31 vii 3.2.9. Lactobacillus spp. Suşları Tarafından Üretilen Bakteriosin veya Bakteriosin Benzeri Maddelerin İnhibitör Etkisinin Belirlenmesi ..............................................31 3.2.10. Lactobacillus spp. Suşlarının Kolesterol Giderimi ......................................32 4. BULGULAR VE TARTIŞMA ....................................................................................34 4.1. İZOLATLARIN İDENDİFİKASYONU ..............................................................34 4.2. Lactobacillus spp. SUŞLARIN ASİT DİRENÇLİLİĞİ........................................37 4.3. Lactobacillus spp. SUŞLARIN YÜKSEK SAFRA TUZU (OXGALL) KONSANTRASYONLARINDA DİRENÇLİLİĞİ.....................................................39 4.4 Lactobacillus spp. SUŞLARININ SAFRA TUZU (KOLİK ASİT) HİDROLİZİ .41 4.5. Lactobacillus spp. SUŞLARININ ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ ........44 4.6. Lactobacillus spp. SUŞLARIN BAZI PATOJEN MİKROORGANİZMALARA KARŞI ANTAGONİSTİK ETKİLERİ ........................................................................47 4.7. Lactobacillus spp. SUŞLARI TARAFINDAN ÜRETİLEN BAKTERİOSİN VEYA BAKTERİOSİN BENZERİ MADDELERİN İNHİBİTÖR ETKİLERİ..........50 4.8. Lactobacillus spp. SUŞLARININ KOLESTEROL GİDERİMİ...........................50 5. SONUÇ VE ÖNERİLER .............................................................................................54 6. KAYNAKÇA...............................................................................................................60 viii TABLOLAR DİZİNİ Tablo 1. Probiyotik olarak bilinen mikroorganizmalar ....................................................6 Tablo 2. Gaitadan izole edilerek tanımlanan suşların adları ve kodları ...........................36 Tablo 3. Lactobacillus suşlarının düşük pH (2.0, 2.5 ve 3.0) derecelerine toleransı. (24 saat sonra).........................................................................................................................37 Tablo 4. Lactobacillus spp. suşlarının değişik düzeyde (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5) safra tuzu (oxgall) toleransı..............................................................................................40 Tablo 5. Lactobacillus spp. suşlarının safra tuzu hidroliz (kolik asit) aktivitesi. ............42 Tablo 6. Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı duyarlılık sonuçları (mm).................................................................................................45 Tablo 7. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılık sonuçları. ..........................................................................................................................46 Tablo 8. Lactobacillus spp. suşlarının değişik patojen bakterilerine karşı oluşturdukları antagonistik etkileri (mm). ...............................................................................................49 Tablo 9: Bazı Lactobacillus suşlarının MRS sıvı besiyerinde ve değişik safra tuzu ( % 0.3 oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) besiyerinde kolesterol giderimi (µg/ml). ........51 ix ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1. Gastrointestinal sistemin değişik kısımlarında yer alan mikroorganizmalar . ....19 Şekil 2. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılık oranları. ............................................................................................................................47 Şekil 3. L. delbrueckii ssp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum LS-11, L. plantarum LS-12 ve L.fermentum LS-15 suşlarının kolesterol giderim miktarları (µg/ml). ..........................................................................................................................................52 x RESİMLER DİZİNİ Resim 1: MRS Agar üzerinde 48 saat inkbasyona bırakılmış L. salivarius LS-22 suşunun Samsung S760 fotoğraf makinesi ile çekilmiş görüntüsü. ...............................................34 Resim 2: L. pentosus LS-2 suşunun Olympus, CH-2 CHT model ışık mikroskobunda 100x10 büyütmede görünümü .........................................................................................35 Resim 3: Hidroliz edilmemiş kolik asit kristali. Novax AP-5 50920 binoküler mikroskobunda 20X büyütmedeki görüntüsü. .................................................................43 Resim 4: L. pentosus LS-2 suşunun gerçekleştirdiği safra tuzu (kolik asit) hidrolizi. Kolik asit kristallerinin parçalanmış hali. Novax AP-5 50920 binoküler mikroskobunda 20X büyütmedeki görüntüsü. ...........................................................................................43 xi SİMGELER VE KISALTMALAR KISALTMALAR ATCC Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu BSH Safta Tuzu hidrolizi BKZ Bakınız FAO Gıda ve Tarım Örgütü GDO Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar GRAS Genellikle güvenli olarak tanınan KOB Koloni Oluşturma Birimi LAB Laktik Asit Bakterileri MRS Man Ragosa and Sharpe NCCLS Klinik Laboratuar Standartları Ulusal Komitesi RPM Devir Sayısı Spp. Species Plural Subsp. Subspecies WHO Dünya Sağlık Örgütü SİMGELER mm Milimetre nm Nanometre °C Santigrad µ Mikron µL Mikrolitre ml Mililitre w/v Weight/Volume µg Mikrogram µm Mikrometre xii dl Desilitre mg Miligram g Gram L Litre xiii 1. GİRİŞ Mikroorganizmalara karşı insanlarda olumsuz bir ön yargı vardır. Genel kanı mikroorganizmaların zararlı olduğu yönündedir. Bu ön yargılı yaklaşımla mikroorganizmalardan korkan insanlar günlük yaşantılarında mikroorganizmaları ‘mikrop’ olarak adlandırmakta ve korunmaya çalışmaktadırlar. Bu önyargılı yaklaşıma rağmen, İnsan vücudu, sahip olduğu ısı ve besin maddeleri sayesinde çeşitli mikroorganizmalar için son derece elverişli bir ortam oluşturmaktadır. Bu ortamda yararlı ve zararlı mikroorganizmalar bir rekabet içindedirler. Genel olarak sağlıklı bir insanda yararlı mikroorganizmalar daha baskın ve vücut hücreleri ile birlikte uyumlu bir şekilde çalışmaktadırlar 1-4. Son yıllarda insan vücudunda yaşayan mikroorganizmalar birçok bilim insanının dikkatini çekmiştir. Bu mikroorganizmalar inceleme altına alınmış, yeni projeler ve çalışmalar başlatılmıştır. Bu alanda yürütülen projeye ‘mikrobiyom projesi’ denilmektedir. Henüz yeni bir proje olmasına karşın ulaşılan bilgiler son derece önemlidir 5,6. Yeni doğmuş bir bebek steril durumdadır. Doğum anından itibaren çevrede bulunan mikroorganizmalar bebeğin vücuduna yerleşmeye başlar, 1-2 gün içinde bu mikroorganizmaların sayısı 109 -1010’u bulur. Bebeğin vücuduna yerleşen mikroorganizmaların tür ve sayısı bebeğin bulunduğu ortama, beslenme şekline ve doğum şekline bağlı olarak değişim gösterir. Bebekte anne sütü kesildiğinde, yetişkin floranın oluşumu başlar 7-10. Yetişkin bir insan vücudu yaklaşık 1013 hücreden oluşmakla birlikte bunun 10 katı kadarda zararlı ve yararlı, 500 farklı türde mikroorganizmaya ev sahipliği yapmaktadır. Bir başka ifade ile vücudun değişik sistemlerinde, sistemin işlevine göre belirli miktarlarda mikroorganizmalar yer alır. Örneğin; deride 200 gr, ağız boşluğunda 20 gr, akciğerlerde 20’şer gr, burunda 10 gr, gözde 1 gr ve gastrointestinal sistemde 1-2 kg mikroorganizma vardır 11-17. 1 Sindirim sistemi çok geniş bir alana sahiptir ve işlevsel olarak çok fazla miktarlarda besin maddesi içermektedir. Bu sistemin yüzey alanı yaklaşık 400 m2’den oluşmaktadır ve bunun 200 m2’de bağırsak mukozası yer alır. Yaşam için gerekli olan enerji ve yapısal madde taşları dışarıdan beslenerek temin edilir. Dışarıdan alınan bu besinler sindirim sisteminden geçerek işlevsel hale getirilir. Bir insanın ömrü boyunca sindirim kanalından ortalama 60 ton yiyeceğin geçtiği hesaplanmıştır. Sağlıklı bir yaşam için sindirim sisteminin çok düzenli bir şekilde çalışması gerekmektedir. Bu sistemin önemini Hipokrat şöyle ifade etmiştir. “Bütün hastalıklar bağırsaktan başlar. Bağırsak hasta ise vücudun geri kısmı da hastadır” 7, 13, 15-20 . Bu kadar geniş yüzeye sahip ve bu kadar işlevsel bir sistemin elbette bir yardımcıya ihtiyacı vardır. Gastrointestinal sistemde yaşayan yararlı mikroorganizmalar, içinde bulunduğu sistem için çok önemli reaksiyonlar gerçekleştirerek bu sistemin düzenli çalışmasına büyük ölçüde katkı sağlamaktadırlar. Bu mikroorganizmalar genel olarak probiyotiklerdir. Probiyotikler, ağız yolu ile alındığında konakçıya belirgin bir yarar sağlayan, düşük pH’da dayanıklı, bağırsak epiteline tutunabilen, patojen olmayan canlı mikroorganizmalardır. Probiyotik kelime olarak Yunanca ‘pro’ ve ‘biota’ kelimelerinden türetilmiştir. ‘Yaşam için’ anlamına gelen probiyotik, antibiyotik kelimesi ile zıt anlamlıdır 21-24. İnsanlar probiyotikleri doğal yollarla almaktadırlar. Eski insanların diyetlerine bakıldığında günümüz insanlarından kat kat daha fazla fermente süt ürünleri tükettikleri görülmektedir. Günümüzde ise insanların diyetlerinde rafine edilmiş, işlenmiş gıdalar yer almaktadır. Ayrıca hareketsiz yaşam, stres, antibiyotik kullanımı, sigara ve alkol kullanımı gibi etkenler sağlıklı bir yaşam için olumsuz etkiler oluşturmaktadır. Bu durumdan bağırsak florası da olumsuz etkilenmektedir ve sayıları azalmaktadır. Bu nedenlerden dolayı bağırsak florasını uygun sayıda tutabilmek için ekstradan probiyotik takviyeleri yapma gereği doğmuştur 4,9,18,25. 2 Bu çalışmanın amacı; Kırşehir Devlet Hastanesine belirli bir şikayetle başvurmuş 25-50 yaş arası sindirim sistemi problemi bulunmayan 48 hastanın gaitasından izole edilerek tanımlanan Lactobacillus türlerinin, düşük pH ve yüksek safra konsantrasyonlarında dayanıklılıklarının, safra tuzu hidrolizinin, antimikrobiyal aktivitelerinin belirlenmesi, serum kolesterol giderimi ve bazı patojen mikroorganizmalara karşı antagonistik etkilerinin ortaya çıkarılması hedeflenmiştir. Böylelikle günlük hayatta normal beslenen kişilerin bağırsak florasında probiyotik tür varlığı belirlenmiş olacağı düşünülmüştür. 3 2. TEORİK ALT YAPI 2.1. PROBİYOTİKLER 2.1.1. Probiyotiklerin Tanımı ve Tarihçesi Probiyotik, Yunanca iki kelime ‘pro’ ve ‘biota’ dan türetilmiştir ve ‘yaşam için’, ‘yaşamsal’ anlamlarına gelmektedir anlamlıdır çıkmıştır 28 29 12,26,27 . Antibiyotik kelimesiyle zıt . Probiyotik kavram olarak ilk kez 19. yüzyılın sonlarına doğru ortaya ve günümüze değin birçok bilim insanı tarafından tanımlandırılmaya çalışılmıştır. Bu kavramı ilk kez 1908 yılında Nobel ödüllü Rus bilim adamı Élie Metchnikoff tanıtmıştır. Yaşlanma üzerine bir takım çalışmalar yapan Metchnikoff, Kafkas ve Bulgar köylülerinin uzun ömürlü olduklarını fark etmiş ve bu durumu köylülerin çok fazla miktarda fermente süt ürünlerini tüketmelerine bağlamıştır. Metchnikoff fermente süt tüketimi ile bağırsak florasının olumsuz etkilerinin ortadan kaldırılabileceği ve böylece insanların daha uzun süre yaşayabileceklerini bildirmiştir 18,30-32 . Probiyotik terim olarak ise ilk kez 1954 yılında Ferdinand Vergin tarafından kullanılmıştır. Vergin ‘Anti und probiotika’ adlı makalesinde probiyotiklerin antibiyotik ve antimikrobiyal maddelerin tersine yaşam için yararlı olduğunu göstermiştir 33,34. Bu çalışmadan 11 yıl sonra Lilly ve Stillwell yaptıkları çalışmalarında bir protoza tarafından salgılanan bir maddenin başka bir protozanın gelişimini teşvik ettiğini gözlemlemişler ve probiyotikler tarafından üretilen maddelerin diğer mikroorganizmaların gelişmesini teşvik edici olduklarını göstermişlerdir 33,35. Probiyotiklerin günümüzde en çok kabul gören tanımı 1989 yılında Roy Fuller tarafında yapılmıştır. Fuller’e göre Probiyotik, “tüketicinin intestinal florasını koruyup gelişmesine yardımcı olan canlı mikrobiyal gıda katkılarıdır.” şeklindedir 36. 4 Avrupa Birliğinin girişimleri ile 1995’te Brüksel’de yapılan probiyotik konulu uzmanlar toplantısında probiyotikler için şu tanım yapılmıştır; sağlığa koruyucu etki gösteren, sindirim, üreme ve solunum sistemleri üzerinde yararlı etkileri olan, canlı, bir ya da birkaç belirli mikroorganizma tarafından oluşan kültürler olarak tanımlanmıştır 37. 2.1.2. Probiyotik Olarak Kullanılan Mikroorganizmalar Kullanılmasıyla birlikte tüketicinin intestinal florasını düzelterek yararlı bir şekilde etkileyen canlı mikroorganizmalar olan probiyotikler genel olarak LAB (Laktik Asit Bakterileri) grubundadır. Yoğurt yapımında kullanılan Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ve Streptococcus thermophilus dışındaki tüm laktik asit bakterileri bağırsak florası elemanlarıdır. Bununla birlikte bazı küf ve maya türlerinin de probiyotik özelliğe sahip olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir 23 . Tropikal bir meyvenin kabuğundan izole edilen Saccharomyces boulardii’nin probiyotik özelliğinin keşfedilmesi buna bir örnektir 12. Probiyotik olarak bilinen mikroorganizmalar tablo 1’de verilmiştir. 5 Tablo 1. Probiyotik olarak bilinen mikroorganizmalar 38-41. BAKTERİLER Lactobacillus L. bulgaricus L. rhamnosus L. cellebiosus L. delbrueckii L. lactis L. acidophilus L. reuteri L. brevis L. casei L. curvatus L. fermentum L. plantarum L. johsonli L. helveticus L. salivarius L. gasse L. sporogenes Bifidobacterium B. adolescentis B. bifidum B. breve B. infantis B. longum B. thermophilum Propionibacterium P. shermanii P. freudenreichii Bacteriodes B. capillus B. suis B. ruminicola B. amylophilus Leuconostoc L. mesenteroides KÜF VE MAYALAR Pediococcus P. cerevisiae P. acidilactici P. pentosaceus Streptococcus S. cremoris S. intermedius S. lactis S. diacetilactis Bacillus B. subtilis B. pumilus B. lentus B. licheniformis B. coagulans Aspergillus A. niger A. oryzae Saccharomyces S. cerevisiae S.boulardii Candida C. torulopsis 2.1.3. Probiyotik Mikroorganizmalarda Aranan Özellikleri Bir mikroorganizmanın probiyotik olarak insanlar tarafından kullanılabilmesi için öncelikli olarak deneysel ve klinik çalışmalarla o mikroorganizmanın probiyotik özelliklerinin kanıtlanması gerekmektedir. Bu çalışmaların iki temel amacı vardır. Birinci amaç probiyotik türlerin belirlenmesi ve bu türlerin sahip olduğu özelliklerin gösterilmesidir. Burada gösterilmek istenen probiyotik özelliklerin türe özgü olmasıdır. İkinci amaç ise seçilen probiyotik türlerin etki mekanizmalarının gösterilmesidir 42. Probiyotik mikroorganizmalarda aranan özellikler aşağıda sıralanmıştır 4, 43-45. Sindirim sırasında meydana gelen olaylardan etkilenmeden canlılıklarının sürdürebilmelidirler, Özellikle asit ve safra yoğunluğu gösterebilmelidirler, 6 yüksek ortamlarda faaliyet Bağırsak epiteline tutunabilme özelliği gösterebilmelidirler, Sindirim sistemi mikroflorasının dengede tutulmasını sağlamalı, patojenlerin gelişimini engellemeli, tüketilen gıdaların yararlanma derecesini artırmalıdırlar, Antibakteriyel direnci patojen mikroorganizmalara nakletmemelidirler, İlave edildiği gıdanın kalitesini düşürmemelidirler, Patojenler üzerine inhibitör etki yapmalıdırlar, Metabolik aktiviteyi düzenlemelidirler, Gıda allerjilerine ve patojenlere karşı immun sistemi güçlendirebilmelidirler, Konakçının gıdalardan daha fazla yararlanmasını sağlamalıdırlar, Patojen ve toksijenik olmamalıdırlar, Mikroorganizmanın adaptasyonunu kolaylaştırmak için insan orijinli suşlar seçilmelidir, Depolama ve kullanma süresince canlı kalmalıdırlar. 2.1.4. Probiyotiklerin Etki Mekanizması Probiyotik mikroorganizmalar, bağırsak sisteminin mikrobiyal dengesini düzenleyerek yararlı etkiler göstermektedirler. Probiyotiklerin bu yararlı etkileri 3 mekanizma üzerinden gerçekleşmektedir 23. 1. Patojen mikroorganizmaların sayılarını azaltmak Antimikrobiyal bileşikler üretmeleri, Besin maddeleri için rekabet etmeleri, Kolonizasyon bölgeleri için rekabet etmeleri. 2. Mikrobiyal metabolizmayı (enzimatik aktiviteyi) değiştirmek Sindirim sistemini düzenleyen enzimlerin üretimi, Amonyak, amin veya toksik enzimlerin üretiminin azalması, Bağırsak duvarının fonksiyonlarının iyileştirilmesi. 7 3. Bağışıklık sistemini iyileştirmek Antikor düzeyinin artması, Makrofaj aktivitesinin artması. 2.1.5. Probiyotiklerin Sağlık Üzerine Etkileri Metchnikoff köylülerin daha uzun ve sağlıklı bir ömür sürdüklerini gözlemlemiş ve bunu köylülerin fermente süt tüketmeleriyle ilişkilendirmiştir. Metchnikoff’a göre insan yaşamının kalitesi ile bağırsak fonksiyonlarının bir bağlantısı vardır ve fermente süt tüketimi de bağırsaklarda yararlı etki yaparak bağırsak fonksiyonlarının daha iyi olmasını sağlamaktadır 30. Teknolojik gelişmelerle birlikte yapılan tıbbi çalışmalar bugün göstermektedir ki probiyotiklerin doğrudan ve dolaylı olarak vücut için yararlı etkileri vardır. Probiyotiklerin deneysel verilerle kanıtlanmış yararlı etkileri şunlardır 23 : Bağırsak epitelinin koruyucu görevi; •Epiteller arası direnci arttır, •Mukus üretimini arttır, •Epitel glikolizasyonunu yönlendirir, •Epitel hücre iskeletini ve sıkı bağlantı bütünlüğünü sağlamlaştırır, •Epitel onarımını destekler, •Epitel hücrelerin ölümünü (apoptoz) önler •Antioksidan etki gösterir. Bağışıklık sisteminin yönlendirilmesi; •Lokal ve toplam IgA üretimini arttırır, •T hücresi yanıtını azaltır, •Fagositik etkinliği arttırır, •Bağışıklık hücrelerinin apoptozunu arttırır, •Sitokin profillerini değiştirir, 8 Bağırsak mikroflorasının doğrudan değişimi; •Patojenin bağırsak duvarına tutunması ile yarışır (yarışmacı dışlama), •Bakteriyosin üretimini arttırır, •Bağırsak lümeninin pH’ını organik asitlerin üretimi yolu ile düşürür. Yapılan çalışmalarla yararlı etkileri kanıtlanan probiyotik mikroorganizmaların bazı klinik uygulamaları aşağıda sıralanmıştır. Akut ishal tedavisinde; Dünyada her 15 saniyede bir çocuk ishal nedeni ile ölmektedir 46 . Yapılan kontrollü çalışmalarda Lactobacillus rhamnosus GG verilen çocuklarda akut ishallerinin sürelerinin kısaldığı gözlemlenmiştir. Rotavirüs etkenli akut ishallerde bazı probiyotik türlerin etkinliği gözlemlenmiştir. Bu türlere L. rhamnosus GG, L. reuteri, L. casei ve Bifidobacterium lactis örnek verilebilir 47, 48 Antibiyotik kullanımına bağlı ishal tedavisinde; Antibiyotik kullanılması ile birlikte bağırsak florası sayı ve tür açısından değişim gösterir. Antibiyotik kullanımı ile karşılaşılan ishallerde genellikle Clostridium difficile’nin sayısal olarak artması sorumludur. Antibiyotik kullanılması ile meydana gelen ishallerin tedavisinde Lactobacillus acidophilus, L. plantarum, L. casei ve Saccharomyces boulardii kullanılmaktadır. S. boulardii, C. difficile’in toksinlerini bağlayarak etkili olmaktadır 49, 50. Helicobacter pylori enfeksiyonunda; H. pylori gastrit, ülser ve mide kanserine yol açan gram negatif bir patojendir. Yapılan laboratuar çalışmaları bazı Lactobacillus türlerinin H. pylori’ye karşı antagonistik etkisinin olduğunu göstermiştir 18 . Ancak bu konuda kullanılacak probiyotik türün tam olarak tespit edilmemesi, uygun miktar ve zamanın belirlenememesi nedeniyle probiyotiklerin tedavi edilmemektedir 51,52. 9 amaçlı kullanımı tavsiye Kolorektal kanser tedavisinde; Probiyotiklerin insanlarda, prokarsinojenlerin aktif karsinojenlere dönüşümünü engelledikleri, mutajenik bileşikleri bağlayıp inaktive ettikleri, antimutajenik madde salgıladıkları, prokarsinojen bakterileri inhibe ettikleri, mutajenlerin bağırsaklardan emilimini azaltarak immün sistemi güçlendirdikleri bilinmektedir. Probiyotikler bu özellikleri sayesinde kolorektal kanser gelişimini önlediği bildirilmiştir 45,53 . Ayrıca büyük çapta yapılan araştırmalar da fermente süt ürünlerinin tüketimi ile kolon ve meme kanseri gelişimi arasında ters bir ilişki gözlemlenmiştir 54. Serum kolesterol seviyesinin düşürülmesinde; Probiyotiklerin kan serum düzeyini düşürücü etki gösterdikleri bazı klinik çalışmalarla kanıtlanmıştır. Vücutta sentezlenen ya da dışarıdan alınan kolesterol safra asitlerine dönüşmektedir. Bazı probiyotik türler, örneğin; L. acidophilus, bu safra asitlerini konjuge edebilme özelliğine sahiptirler. Konjuge edilen safra asitleri lipitlere göre daha kolay emilir. Bu sayede serum kolesterol seviyesinde düşme meydana gelir. Bu konuda yapılan bir çalışmada hiperlipidemik hastalara 3 ay süreyle L. sporogenes verildiğinde serum kolesterol düzeyinin % 32 oranında azaldığı gözlemlenmiştir 4, 55-57. 2.1.6. Probiyotiklerin Yan Etkileri Probiyotikler patojen olmayan mikroorganizmalar olsalar da bağışıklık sistemi iyice zayıflamış kişiler için tehlikeli olabilmektedirler. Bağışıklık sistemi zayıflamış kişilerde probiyotiklerin sistemik enfeksiyonlara yol açtığı bildirilmiştir. Bunun yanı sıra probiyotiklerin olası diğer yan etkileri metabolizma değişikliği ve gen transferidir 47,58,59 . Probiyotiklerle ilgili olarak insanların bir diğer endişesi de kullanılan preparatların GDO (genetik yapısı değiştirilmiş organizmalar) olup olmadığı konusudur 43. 10 2.1.7. Probiyotik Ürünler ve Ticari Önemleri Probiyotik ürünler, vücut için yararlı olduğu kanıtlanmış probiyotik mikroorganizmaların eklenerek tüketicilere sunulan ürünlerdir. Bu ürünlerin en başında yoğurt, kefir ve peynir gibi fermente süt ürünleri gelmektedir. Gelecekte probiyotik et ürünlerinin de üretilmesi planlanmaktadır 60. Probiyotik mikroorganizmalar belirli bir araştırma sonucu yararlı oldukları anlaşılan canlılardır. Probiyotikler üzerine yapılan çalışmalar her ne kadar gün geçtikçe artmış olsa da bazı nedenlerden dolayı sınırlı kalmıştır 61. Bu nedenler, çok fazla sayıda probiyotik tür ve suşun bulunması, bu canlılara ait özelliklerin tam olarak bilinmemesi, farklı muhafaza koşullarının bu canlıları nasıl etkileyeceğinin tam olarak bilinmemesi, tek suşun bile bireylerde farklılık göstermesi ve detaylı klinik uygulamaların maliyetinin yüksek olmasıdır 61. Probiyotik ürünlere karşı olan ilgi gün geçtikçe artmaktadır. Bu durum üreticilerin dikkatini çekmekte ve bu yönde ürün pazarlamaktadırlar. Tüketicilerin bu konuda çok dikkatli olmaları gerekmektedir. Ürün alımında markalı ve patentli ürünleri tercih edilmelidir 42, 61. 2.2. PREBİYOTİKLER ve SİNBİYOTİKLER 2.2.1. Prebiyotikler Kolon bakterilerinin çoğalmalarını sağlayan, aktivitelerini artıran, kolonize olmalarını kolaylaştıran ve fermente olabilen gıda katkılarıdır. Probiyotiklerin ihtiyaç duydukları besin maddeleri olan prebiyotikler sindirilmeyen karbonhidratlardır 62-64. 11 Disakkaritlerden olan laktuloz, inülin en çok bilinen prebiyotiklerdir. Bunların dışında oligosakkaritleden maltoz, ksiloz ve galaktooligosakkaritlerden oligofruktoz, galaktoz diğer prebiyotik besinsel kaynaklardır 65. Hindiba ve enginar en fazla prebiyotik içeren besinlerdir. Bunların dışında arpa, buğday, çavdar, soğan, sarımsak, muz, kuş konmaz ve pırasa da prebiyotik ihtiva eden besin kaynaklarıdır 64. Bir besin kaynağının prebiyotik olarak kullanılabilmesi için şu özellikleri taşıması beklenir 62,66. Sindirime dirençli olmalı, Kolon mikroflora bakterileri tarafından hidrolize edilmeli, Bir veya kısıtlı sayıda olmak üzere daha çok bakterinin çoğalmasını stimüle etmeli, Konakçının sağlığı üzerinde olumlu etkileri olmalı 2.2.2. Sinbiyotikler Sinbiyotikler, probiyotiklerle birlikte prebiyotiklerin karıştırılarak hazırlanmasıyla oluşan besin ve destek amaçlı ürünlerdir. Probiyotiklerin besin maddesi olan prebiyotiklerle birlikte verilmesi ile onların daha uzun süre canlı kalabilecekleri düşünülmektedir. Böylece sinbiyotiklerin sağlığa olumlu etkileri probiyotik ve prebiyotiklerin ayrı ayrı uygulanmalarına göre daha fazla olacağı ön görülmektedir 67,68 . Lactobacillus türleri ile Lactitol’un birlikte verilmesi buna bir 19 örnektir . 2.3. Lactobacillus CİNSİNE AİT BAKTERİLERİN ÖZELLİKLERİ Lactobacillus cinsi bakteriler Lactobacillaceae familyasına ait olup LAB (Laktik Asit Bakterileri) grubundandır. Lactobacillus türleri gram pozitif, katalaz 12 negatif, spor oluşturamayan, genelde hareketsiz, fakültatif anaeorob veya mikroaerofilik mikroorganizmalardır. Çoğu basil olmakla birlikte bazı türler kokobasildir 69-71. Lactobacillus türlerinin gelişebilmeleri için aminoasit, peptit, nükleik asit türevi vitamin, tuz, yağ asidi veya yağ asidi esterleri ile fermente edebilecekleri besin maddelerine ihtiyaç duyarlar 72 . Ayrıca gelişebildikleri optimum sıcaklık 30-40°C arasıdır. Bu mikroorganizmalar fermentasyon sonucu laktik asit ürettikleri için ortamı pH’sını 3.2-3.5’e kadar düşürürler. Bu nedenle de aside dayanıklıdırlar 73. Elektron mikroskobuyla yapılan incelemelerde Lactobacillus cinsi bakteriler 5 ana kısımdan oluştuğu gösterilmiştir. Bunlar hücre duvarı, sitoplazmik membran, ribozomlar ve nükleer (kromozomlar ve plazmidler) elementlerdir 74. Hücre duvarı; Lactobacillus cinsi bakterilerde 20-40 nm kalınlığında, mineral maddeler (tuz vb.), su ve metabolitleri geçirebilen peptidoglikan (murein) bir tabakaya sahiptirler Peptidoglikan, N-asetilglikozamin ve N-asetilmurminik asit monomerlerinden oluşurlar. Hücre çeperinde bu monomerlerin dışında teikoik asit, şekerler, proteinler ve nötr polisakkaritler de bulunur. Teikoik asit hücre duvarının negatif yükünden ve antijenik karakterinden sorumludur. Teikoik asit, ribitol fosfat veya gliserol fosfat polimerlerinden oluşurlar. Bakterilerin hücre duvarı, çoğalma ve azotlu maddelerin parçalanmasında rol alan proteaz enzimlerine sahiptirler 74. Probiyotiklerin en önemli karakteristik özelliklerinden bir tanesi bağırsak adhezyon yeteneğine sahip olmalarıdır. Bu yeteneğinde hücre duvarında bulunan teikoik asit ve lektin benzeri maddelerden kaynaklandığı belirtilmiştir 75. Sitoplazmik membran; Laktik asit bakterilerinin proteinleri kullanabileceği büyüklüğe getirilmesi için gerekli olan enzimler burada bulunmaktadır. Aynı zamanda bu reaksiyon sitoplazmik membranda gerçekleştirilmektedir. Bunun yanında sitoplazmik membranda fosfotransferaz enzimleriyle aktif taşımada 13 yapılmaktadır. Peptidoglikanların ekstrasellüler polimerizasyonu için gereken enzimler de sitoplazmik membranda bulunmaktadır 74. Ribozomlar: LAB ribozomları 70S tipindedir. 70S, 50S büyük ve 30S küçük olmak üzere iki alt üniteden oluşur. 50S’lik büyük alt birim 5S r-RNA ve 23S r-RNA ile yaklaşık 35 çeşit protein; 30S’lik küçük alt birim ise 16S r-RNA ve 25 farklı protein içerir. Laktik asit bakterilerinin birbirlerinden ayırımında 16S r-RNA’nın özelliklerinden yararlanılmakta ve 16S r-RNA’nın değişen ve değişmeyen kısımlar bulunur. Değişen kısımlar yakın akrabalıkları, değişmeyen kısımlar ise uzak akrabalıkların tespitinde kullanılmaktadır 74. Plazmid: Laktik asit bakterilerinin çoğu en az bir adet plazmid içerir. Plazmidler, ekzopolisakkarit ve antimikrobiyal madde sentezi gibi koruma görevi üstlenmiştir 74. Laktik asit bakterileri, glikozu laktik asit veya bunun yanında diğer ürünlere fermente etme özelliklerine göre homofermantatif ve heterofermantatif laktik asit bakterileri olarak iki ana gruba ayrılmaktadır. Bu ayırım şekerlerin temel yıkım yollarındaki farklılıktan kaynaklanmaktadır 76. Homofermantatif laktik asit bakterileri glukozu, Fruktoz Di Fosfat (FDP) yolu ile parçalayarak fermantasyon sonucu % 99 oranında laktik asit, % 1 oranında diğer bileşikleri meydana getirirler 76-79. Homofermantatif yol: C6H12O6 2 CH3-CHOH-COOH (Laktik Asit) C6H12O6 CH3-CHOH-COOH + CH3-CH2-OH + CO2 14 Heterofermantatif laktik asit bakterileri, glikozu Hegzos Mono Fosfat (HMF) yolu ile parçalayarak fermantasyon sonucu % 70 laktik asit üretilir. % 30 oranında da diğer bileşikleri, özellikle asetik asit, etil alkol ve karbondioksiti oluştururlar 77-79. Heterofermantatif yol: C6H12O6 CH3-CHOH-COOH + CH3-COOH + CO2 Lactobacillus türleri tarafından fermantasyon sonucu üretilen laktik asidin fermente ürünleri koruyucu etki göstermesinden dolayı, bu mikroorganizmalar yıllardır gıda endüstrisinde kullanılmaktadırlar. Ayrıca bakteriosin ve diğer antimikrobiyal madde üretimleri ve GRAS (Genellikle güvenli olarak tanınan) statüsünde yer almaları nedeniyle, doğal ve teknolojik uygulamalarla üretilen ve bu bakterileri içeren gıdalar insan sağlığını hiçbir şekilde olumsuz olarak etkilemezler 70 . 2.3.1 Lactobacillus Türlerinin Ürettikleri Antimikrobiyal Maddeler Laktik asit bakterileri, insan sağlığına faydalı olmaları ve fermantasyon yapabilmelerinden dolayı, gıdalarda uzun yıllardan beri güvenli bir şekilde kullanılmaktadırlar. Bu nedenle gıda endüstrisinde büyük öneme sahiptirler. Ayrıca bu bakterilerin gıdaların biyokontrolünde de ayrı bir önemi vardır. Patojen olan bakterilerin birçoğu Laktik asit bakterileri tarafından son ürün olarak üretilen bazı maddelere karşı hassastırlar. Laktik asit bakterilerinin antagonistik etki mekanizmaları içerisinde son yıllarda üzerinde en fazla durulan maddeler Laktik asit, Hidrojen peroksit (H2O2) ve Bakteriosindir 80-83. 2.3.1.1. Laktik asit Laktik asitler, laktik asit bakterileri tarafından laktozun yıkımı sonucu oluşan maddelerden biridir. Ekşi tatta ve kokusuz bir organik asittir. Laktik asit 15 bakterilerinin söylenebilir inhibisyon 80,81 etkisinin çoğunlukla laktik asitten kaynaklandığı . Laktik asit oluşumu, iki basamaklı reaksiyon sonucu meydana gelir. İlk olarak laktozun, laktik asit bakterileri tarafından oluşturulan laktaz (β-galaktosidaz) enziminin etkisiyle, glikoz ve galaktoza parçalanması gerçekleşir. Bunun ardından da glikoz laktik aside dönüşür 82. Laktaz (β-Galaktosidaz) Laktoz + H2O Glikoz + Galaktoz 2C6H12O6 4CH3CHOHCOOH Laktik asit Bu değişim, homofermantatif laktik asit bakterilerinin, Embden-MeyerhofParnas’ın belirttiği fruktoz-1,6 difosfat metabolik yolunu izleyerek, glikoz molekülünü, 3C’lu piruvata ve ardından laktik aside dönüştürmesiyle gerçekleşir. Ancak ortamda heterofermantatif laktik asit bakterileri varsa bu bakteriler, glikozun yıkımını Embden-Meyerhof-Parnas yolu yerine fosfoketolaz glikolitik yolu kullanılır. Sonuçta laktik asidin yanı sıra asetik asit, etil alkol, ve CO2 gibi maddelerde açığa çıkar 82. Laktozun fermantasyonu sonucunda, D (-) ve L (+) laktik asit olmak üzere iki laktik asit izomeri meydana gelir. L (+) laktik asit, insan organizmasında daha hızlı ve kalıntı kalmayacak şekilde metabolize olur. D (-) laktik asit ise çok yavaş bir şekilde yıkıma uğrar. Bu nedenle vücuda fazla miktarda D (-) laktik asidi alınımı istenmez. WHO (Dünya sağlık örgütü) ile FAO (Dünya gıda örgütü) tarafından, günlük D (-) laktik asit alınımı 60 mg/kg vücut ağırlığı ile sınırlandırılmıştır 82. Laktik asit, tabiatta çok yaygın olarak bulunan asitlerden birisidir ve geniş şekilde gıda koruyucusu olarak kullanılmaktadır. Laktik asit insanlar tarafından peynir, tereyağı, bira, ekmek hamuru, süttozu içeren gıdalar, sığır, koyun ve kanatlı karkaslarında koruyucu olarak kullanılmaktadır 83. 16 2.3.1.2. Hidrojen peroksit (H2O2) Bazı laktik asit bakterilerinin antimikrobiyal etkileri H2O2 üretimlerine dayandırılmaktadır. H2O2 laktik asit bakterileri gibi katalaz negatif mikroorganizmalar tarafından aerobik şartlarda üretilmektedir. Ksantin oksidaz, glukoz oksidaz, askorbik asit, sulfidril oksidaz, piruvat oksidaz, NADH oksidaz ve αgliserofosfat oksidaz veya laktat oksidaz gibi enzimlerin varlığında gerçekleşen reaksiyonlarda atmosferik oksijenin doğrudan indirgenmesi ile meydana gelmektedir 83, 84 . D-glikoz + H2O + O2 D-glukonik asit + H2O2 H2O2’nin üretimi 5 °C ve 7 °C’de en yüksek seviyeye ulaşmaktadır ki bu durum asit üretimi ile zıtlık göstermektedir 85. Hidrojen peroksit termodinamik açıdan kararsız bir bileşiktir. Ortama da katalaz varlığında su ve oksijene ayrılır 86. Katalaz 2 H2O2 2H2O+O2 2.3.1.3. Bakteriosin Bakteriosinler, çeşitli laktik asit bakterileri tarafından üretilen, protein veya peptid yapıda, hassas hücrelerdeki reseptörlere bağlanabilen antimikrobiyal maddelerdir. Üretimleri büyük oranda plazmid DNA tarafından kodlanmaktadır. Laktik asit bakterilerinin tüm cinslerinde bakteriosin üretimi belirlenmiştir. Özellikle, Streptococcus ve Lactobacillus cinslerinde bu metabolitin üretimi oldukça yaygındır. Bu cinsler içerisinde sınıflanan türlerin, bakteriosin üretim sıklıkları da birbirinden farklılık göstermektedir 83. 17 Protein veya peptitlerden oluşan ve diğer mikroorganizmalara karşı antogonistik etki gösteren bakteriosinlerin proteolitik enzimlerle inhibe edilebileceği açıklanmıştır 87. 2.4. BAĞIRSAK MİKROFLORASI Metchnikoff sağlıklı bir yaşam için bağırsakların çok önemli bir organ olduğunu düşünmekteydi. Yaşamı boyunca bağırsaklarda gerçekleşen olayları çözmeye çalışmış ve bu organın önemini vurgulamıştır. Bu konudaki düşüncelerini hastalandığı sırada arkadaşına şöyle ifade etmiştir. “Otopsimi yapacak mısın? Bağırsaklarıma dikkatli bak, orada bir şeyler olduğunu düşünüyorum 30.” Gastrointestinal sistem insan vücudunda 400m2’lik bir alana sahiptir. Bu sistemin 200m2’sini oluşturan bağırsaklar emici yüzeyi ile gıdaların sindirildiği, bileşenlerin absorbe edildiği, posa kısımların dışkı olarak atıldığı bir organdır. Bunların yanı sıra insan vücudununki en büyük diffüz lenfoid bir doku özelliğinde olan mukozası ile mükemmel bir bağışıklık sistemi organıdır 19,88,89. Bir insanın yaşamı boyunca yaklaşık 60 ton yiyeceğin gastrointestinal sisteminden geçtiği hesaplanmıştır 19 . Bu sistem, çok geniş bir yüzey alanına sahip olması, besin maddelerinin burada sindirilmesi ve insan vücudunun sahip olduğu ısı sayesinde mikroorganizmalar için son derece uygun bir ortam oluşturmaktadır. Yeni doğmuş bir bebek steril durumdadır. Doğumdan hemen sonra çevresindeki mikroorganizmalarla kontamine olur. İlk olarak E. coli ve Streptococcus türleri baskındır. Bebek anne sütü ile beslendikçe bu mikroorganizmaların yerini Bifidobacterium türleri alır. Anne sütü kesildiğinde yetişkin florası oluşmaya başlar. Yetişkin bir insanın bağırsaklarında yaklaşık 500 farklı türde mikroorganizma gelişebilir. Bu mikroorganizmalar kütlece 1-2 kg’a kadar ulaşabilmektedirler 18. 18 Gastrointestinal sistemi oluşturan kısımlar mikroorganizmalar için farklı ortamlar sağlarlar. Bu nedenle her kısımda farklı türde mikroorganizmalara rastlanmaktadır. Gastrointestinal sistemde yer alan mikroorganizmalar ve yerleri Şekil 1’de gösterilmiştir. Şekil 1. Gastrointestinal sistemin değişik kısımlarında yer alan mikroorganizmalar 18. 2.5. ANTAGONOSTİK ETKİDE KULLANILAN MİKROORGANİZMALAR Patojen mikroorganizmalara karşı mücadelede kullanılan yöntemler önemli bir konudur. Hem ekonomik açıdan hem de kullanılan ilaçların yan etkisi bakımından en ideal olan seçilmelidir. Probiyotik bakterilerin vücut savunmasına yardımcı olduğu bilinmediktedir. Bu amaçla çalışmamızda kullanılan Lactobacillus 19 suşlarının günümüzde en yaygın olan patojenlere karşı antogonistik etkileri araştırılmıştır. Çalışmada kullanılan patojen mikroorganizmalar aşağıda verilmiştir 2.5.1. Escherichia coli Sınıflandırmada Enterobacteriaceae familyasında yer alan E. coli; gram negatif, çubuk şeklinde, fakültatif anaerob, peritrik kirpikli ve kapsüler yapıda olan bir bakteridir. Boyutları 1-2 µm uzunluğunda ve 0.1-0.5 µm çapındadır. E. coli laktozu fermente edebilme özelliğine sahiptir 70, 90. E. coli bakterilerinin doğal yaşam ortamları insan ve hayvanların bağırsaklarıdır. Bu özelliklerinden dolayı su ve besinlerde fekal kirlenmenin göstergesidir. E. coli fırsatçı bir patojendir. İnsanlarda bakteri enfeksiyonlarında en sık rastlanan etkendir. Aslında bağırsak mukozasına yerleştiklerinde diğer patojenlerle rekabet halindedirler. Ancak normal flora üyesi olarak bulundukları yerden başka yerlere ulaşırlarsa ve burada üremeleri için elverişli koşullar varsa bağırsak dışı enfeksiyonlar neden olmaktadırlar 90. 2.5.2. Staphylococcus epidermidis S. epidermidis, Micrococcaceae familyasından olup gram pozitif ve kok şeklinde fakültatif anaerob bir bakteri türüdür. Katalaz pozitif ve koagülaz negatif özelliktedir. Zaman zaman insan ve hayvan cildinin mukoz membranlarında görülür 90,91 . S. epidermidis klasik fırsatçı patojenlerdendir. Yabancı cisimlerin yüzeylerinde biyofilm oluşturma yetenekleri nedeniyle yabancı cisimlerle ilişkili enfeksiyonlara neden olur. Bu açıdan immün sistemi yetersiz çalışan hastalar ve sürekli kateter takılı olan hastalar için büyük bir risktir 90, 91. 20 2.5.3. Neisseria sp. Neisseria, gram negatif, aerob, hareketsiz, sporsuz, bazen kapsüllü, oksidaz pozitif, katalaz pozitif, 0.6-1.0 µm çapındadır. İkili kokobasil ve kısa zincirler halinde görülebilir. Neisseria’lar genelde kok şeklinde olduklarından iki dik boyutta bölünerek diplokok (mikroskopla bakıldığında kahve tanesine benzer bir yapıda) görülebilirler. İnsan vücudu dışında kısa sürede ölen tipik mukaza parazitleridir 90, 92. İnsanlarda patojen olan türler asıl olarak N. gonorrhoeae ve N. meningitidis olup, N. flavescens, N. subflava, N. mucosa, N. sicca, N. cinerea, N. lactamica, N. denitrificans, N. elongata, N. weaveri patojen özellik göstermeyip nazofarinks mukozasında flora elamanı olarak bulunur 90. 2.5.4. Klebsiella pneumoniae K. pneumoniae; hareketsiz, sporsuz, 1-2 µm boyunda ve 0.5-0.8 µm eninde ikişerli ya da kısa zincir halinde basillerdir. Gram negatif, polisakkarid yapıda kapsüllü, aerop ve fakültatif anaerop özellik gösterebilen, 37 °C ve pH 7’de iyi üreyen bakterilerdir 93. E. coli gibi Enterobacteriaceae familyasında yer alan K. pneumoniae, sağlıklı insanlarda üst solunum yolu ve dışkı florasının % 5-10’unu oluşturan bir bakteri olduğu için patojenliği uygunsuz koşullar karşısında fırsatçı patojen olarak ortaya çıkar. Bu nedenle hastane enfeksiyonlarından sorumlu bir bakteridir 93, 94. K. pneumoniae, pnömoninin yanı sıra idrar yolları enfeksiyonuna, yara enfeksiyonuna ve bakteriyemiye neden olmaktadır 93. 21 2.5.5. Pseudomonas aeruginosa Gram negatif, zorunlu aerobik, basil veya kokobasil şeklinde, 0.5-0.8 µm eninde 1.5-3.0 µm boyunda, sporsuz ve polar flagellası ile hareket edebilen, katalaz pozitif, sitrat pozitif, metil kırmızısı negatif, Voges Proskauer negatif, bir bakteri olan P. aeruginosa, insan patojenidir. En iyi 37 °C’de üremekte olup 42 °C’de de üreyebildikleri rapor edilmektedir 93, 95. Genç kültürler, üzerinde büyüyebildiği ortamlarda genellikle mavi-yeşil bir pigment çıkarır. Aerobik olmaları nedeni ile gıdaların yüzeyinde hızlı gelişebilmeleri sonucu okside ürünler ve mukoz madde oluştururlar 93. 22 3. MATERYAL VE METOD 3.1. MATERYAL 3.1.1. Materyal Örnekleri Bu çalışmada kullanılan 25 adet Lactobacillus cinsine ait bakteriler, belirli bir şikayet üzerine Kırşehir Devlet Hastanesine başvuran 25-50 yaş arası 48 hastanın gaitasından izole edilmiştir. Örneklerin alımında hastalarda bağırsak problemlerinin olmamasına dikkat edilmiştir. Lactobacillus spp. suşlarının antagonistik etkilerinin tespiti için kullanılan E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria sp. İzmir Behçet Uz Çocuk Hastanesi kültür kolleksiyonundan temin edilmiştir. 3.1.2. Bakterilerin Aktifleştirilmesi ve Gelişme Ortamları Çalışmada kullanılan tüm test bakterileri uygun sıvı besiyeri ve sıcaklıkta 2448 saat inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Lactobacillus türleri için MRS (Man Ragosa and Sharpe) broth ve agarı (Merck) kullanılmıştır. Ayrıca Lactobacillus suşlarının antimikrobiyal analizi için sisteinli MRS agar kullanılmıştır. Lactobacillus suşlarını inhibitör etkilerinin tespiti için kullanılan E. coli (ATCC 25922), S. epidermidis (ATCC 12228), Neisseria sp., K. pneumoniae (ATCC 25656) ve P. aeruginosa (ATCC 27853), aktifleştirilmesi ve stoklanması için Nutrient sıvı ve katı besiyeri (Merck), inhibitör etki çalışmasında ise Muller Hinton katı besiyeri (Merck) kullanılmıştır. 23 3.1.3. Çalışmalarda Kullanılan Besiyerleri MRS (Man Ragosa and Sharpe) Sıvı Besiyeri Maddeler g/L Pepton 10.0 Beef Ekstrakt 10.0 Yeast Ekstrakt 5.0 Glikoz 20.0 Tween 80 1.08 mL K2HPO4 2.0 Sodyum Asetat.3H2O 5.0 Tri-Amonyum Hidrojen Sitrat 2.0 MgSO4.7H2O 0.2 MnSO4.4H2O 0.05 Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Besiyerinin pH’sı 0.01 N HCl ve 0.01 N NaOH kullanılarak 6.2 ± 0.2’ye ayarlanmıştır. Amaca uygun olacak şekilde besiyerine %1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır. Hazırlanan bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 96 . Nutrient Sıvı Besiyeri Maddeler g/L Pepton 5.0 Beef Ekstrakt 1.0 Yeast Ekstrakt 2.0 Sodyum Klorür 5.0 Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Besiyerinin pH’sı 0.01 N HCl ve 0.01 N NaOH kullanılarak 6.2 ± 0.2’ye ayarlanmıştır. Amaca uygun olacak şekilde besiyerine % 1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır. 24 Hazırlanan bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 97 . Sisteinli MRS Besiyeri Maddeler g/L Pepton 10.0 Beef Ekstrakt 10.0 Yeast Ekstrakt 5.0 Glikoz 20.0 Tween 80 1.08 mL K2HPO4 2.0 Sodyum Asetat.3H2O 5.0 Tri-Amonyum Hidrojen Sitrat 2.0 MgSO4.7H2O 0.2 MnSO4.4H2O 0.05 L-Sistein 2.0 Na2HPO4 2.0 Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Amaca uygun olacak şekilde besiyerine % 1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır. Hazırlanan bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 98. Muller Hinton Besiyeri Maddeler g/L Meat infusion 2.0 Casein hydrolysate 17.5 Starch 1.5 Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Amaca uygun olacak şekilde besiyerine % 1.5 oranında agar ilave edilerek katı besiyeri hazırlanmıştır. Hazırlanan bütün besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 99. 25 Düşük Asitli (pH 2.0, 2.5 ve 3.0) MRS Sıvı Besiyeri Maddeler g/L Pepton 10.0 Beef Ekstrakt 10.0 Yeast Ekstrakt 5.0 Glikoz 20.0 Tween 80 1.08 mL K2HPO4 2.0 Sodyum Asetat.3H2O 5.0 Tri-Amonyum Hidrojen Sitrat 2.0 MgSO4.7H2O 0.2 MnSO4.4H2O 0.05 Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. MRS sıvı besiyeri 3 N HCl ile pH 2.0, 2.5 ve 3.0 ayarlanmış ve 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda sterilizasyon yapılmıştır 100. Yüksek Konsantrasyonlu Safra Tuzlu (%0.3, %0.5, %1.0 ve %1.5 Oxgall) MRS Besiyeri Maddeler g/L Pepton 10.0 Beef Ekstrakt 10.0 Yeast Ekstrakt 5.0 Glikoz 20.0 Tween 80 1.08 mL K2HPO4 2.0 Sodyum Asetat.3H2O 5.0 Tri-Amonyum Hidrojen Sitrat 2.0 MgSO4.7H2O 0.2 MnSO4.4H2O 0.05 26 Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Sıvı MRS besiyerine % 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5 (w/v) oranlarda safra tuzu (oxgall) ilave edilmiştir. Besiyerleri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 101. Safra Tuzu Hidroliz Besiyeri Maddeler g/L Pepton 10.0 Beef Ekstrakt 10.0 Yeast Ekstrakt 5.0 Glikoz 20.0 Tween 80 1.08 mL K2HPO4 2.0 Sodyum Asetat.3H2O 5.0 Tri-Amonyum Hidrojen Sitrat 2.0 MgSO4.7H2O 0.2 MnSO4.4H2O 0.05 Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Safra tuzu,% 0.5 kolik asit, % 0.37g/L CaCl2 ilave edilmiştir. Hazırlanan besiyeri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 102. Antagonistik (% 0.2’lik glikozlu) MRS Sıvı Besiyeri Maddeler g/L Pepton 10.0 Beef Ekstrakt 10.0 Yeast Ekstrakt 5.0 Glikoz 0.20 Tween 80 1.08 mL K2HPO4 2.0 Sodyum Asetat.3H2O 5.0 Tri-Amonyum Hidrojen Sitrat 2.0 MgSO4.7H2O 0.2 MnSO4.4H2O 0.05 27 Maddeler 1000 mL distile suya ilave edilmiştir. Hazırlanan besiyeri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir 103. 3.2.METOD 3.2.1. İzolatların İzolasyonu ve İdendifikasyonu Kırşehir Devlet hastanesine başvurmuş 25-50 yaş arası 48 hastadan alınan gaitalar steril serum fizyolojik ile seyreltilerek MRS agar üzerine çizgi ekim yapılmış, anaerob jarda 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda petrilerde oluşan kirli beyaz, beyaz ve opak koloniler alınmış, faz-kontrast mikroskopta Gram özelliği incelenerek, Gram pozitif, basil bakteriler seçilerek numaralandırılmıştır 104 . Numaralandırılan suşların idendifikasyonu API 50 CHL Medium (Bio Mérieux La Bali Grottes, France) kullanılarak yapılmıştır. API 50 CH mikroorganizmaların karbonhidrat metabolizmasının çalışmasını sağlayan 50 biyokimyasal testten oluşan bir sistemdir. API 50 CH, Lactobacillus ve ilgili türlerin tanımlanması için API 50 CHL Medium ile kullanılır. API 50 CH stribi, karbonhidrat ailesi ve onun türevlerine ait olan substratların fermantasyonunu kullanan 50 mikro tüp içermektedir. Fermantasyon testleri substratları sulandıran API 50 CHL Medium ile eklenir. İnkübasyon sırasında, fermantasyon asidin anaerobik üretimi ile ve seçilen besiyerinde bulunan pH indikatörü tarafından saptanan tüpte renk değişimi olarak ortaya çıkar. 3.2.2. Lactobacillus spp. Suşlarının Muhafazası Eppendorflar, içerisine yaklaşık 300 µL gliserol (Merck) dağıtılarak, 121 °C’de 15 dakika süreyle steril edilmiştir. Gaitadan izole edilen suşlar MRS broth besiyerinde 37 °C’de 24 saat süreyle anearob ortamda ard arda iki kez aktifleştirilmiş, aktif kültürlerden 600 µL alınarak gliserol içeren steril eppendorflara 28 paralelli olarak aktarılmıştır. Derin dondurucuda -20 °C’de depolanarak muhafaza edilmiştir 81. 3.2.3. Patojen Suşların Aktifleştirilmesi ve Muhafazası Lactobacillus suşlarının patojen mikroorganizmalar üzerine antagonostik etkilerinin tespiti amaçlı kullanılan E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria sp. bakterileri Nutrient Broth besiyerinde 37 °C’de 24 saat inkübasyona bırakılarak aktifleştirilmiş olup yatık Nutrient Agar besi yerinde + 4 °C’de buz dolabında muhafaza edilmiştir 105. 3.2.4. Asit Dirençliliğinin Belirlenmesi 16 saatlik durgun fazdaki aktif Lactobacillus spp. suşları, HCl (3.0 M) ile farklı pH değerlerine ayarlanan (2, 2.5 ve 3) taze MRS broth besi yerine inoküle edilmiştir. Daha sonra örnekler 37 °C’de 3 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası alınan örneklerin ortalama asitliğini nötralize etmek için, hazırlanan PBS (Fosfat solüsyonu) çözeltisinde (0.01M ve pH 6.2 şeklinde ayarlanmış) seri dilüsyonlar (10-1 10-7) yapılmış, seyreltilen kültürlerden 100 µL alınarak MRS katı besiyeri üzerine drigalski spatülü yardımı ile yayma ekim yapılmıştır. 37 °C’de 24 saatlik inkübasyon sonrası petri yüzeyindeki canlı mikroorganizma sayısı tespit edilmiştir 100. 3.2.5. Yüksek Safra Tuzu (Oxgall) Konsantrasyonlarına Dirençliliğin Belirlenmesi İzole edilmiş türlerin safra tuzu varlığında canlılığını koruyabilirliği, Dunne ve ark.(2001) metoduna göre yapılmıştır. İçerisine % 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5 (w/v) oranlarda oxgall (sigma) ilave edilmiş MRS broth besiyerine, 16 saatlik durgun fazdaki Lactobacillus spp. suşları inoküle edilerek, 37 °C’de 3 saat inkübasyona 29 bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda her kültürden 5 log10 CFU (105 CFU) fizyolojik su içerisinde dilisyon yapılmıştır. Seyreltilen kültürlerden 100 µL alınarak MRS katı besiyeri (pH 6.2) üzerine yayma ekim yapılarak 37 °C’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası plak üzerinde canlı koloni sayımı yapılmıştır 106, 107. 3.2.6. Safra Tuzu (Kolik Asit) Hidrolizinin Belirlenmesi Lactobacillus spp. suşlarının Safra tuzu (kolik asit) hidrolizinin belirlenmesi amacı ile hazırlanan MRS agar besiyerine % 0.5 kolik asit, % 0.37 g/L CaCl2 ilave edilmiştir. Hazırlanan bu besiyeri 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir. Sterilizasyon sonrası petrilere dökülen besiyerleri soğumaya bırakılmış soğuyan besi yerine 16 saatlik taze kültürlerden 10 µL alınarak yayma ekim yapılmıştır. 24 saat 37 °C’de inkübasyona bırakılan suşların safra hidroliz aktivitesi, inkübasyon sonrasında opak tanecikli beyaz kolonilerin etraflarında zon oluşturma ve oluşturmama özelliklerine göre değerlendirilmiştir 102, 108. 3.2.7. Antimikrobiyal Aktivitenin Belirlenmesi Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının ampisilin (10 µg), basitrasin (10 unit), eritromisin (15 µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg) penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg), rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg), teikoplanin (30 µg), tetrasiklin (30 µg), trimetoprim (5 µg), vankomisin (30 µg), antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları test edilmiştir. İzole edilmiş Lactobacillus spp. suşları 37 °C’de ard arda iki kez MRS sıvı besiyerinde aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden 100 µL alınarak sisteinli MRS katı besiyeri içeren petrilere aktarılmış, steril drigalski spatülü ile yayma ekim yapılmıştır. İçerisinde besiyeri ve bakteri içeren bu petriler üzerine denenecek olan antibiyotik diskler steril bir şekilde yerleştirilmiş ve 37 °C’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda antibiyotik disk çevresinde oluşan zonların 30 çapları kumpas ile milimetrik olarak ölçülmüştür. Sonuçlar NCCLS (Klinik Laboratuvar Standartları Ulusal Komitesi) kriterlerine göre değerlendirilmiştir 109-112. 3.2.8. Bazı Patojen Mikroorganizmalara Karşı Antagonostik Etkilerin Belirlenmesi İzole edilen Lactobacillus suşları 37 °C’de ard arda iki defa MRS sıvı besi yerinde aktifleştirilmiştir. Aktif kültürler 5000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda elde edilen süpernatant steril şartlarda alınıp 0.45 µm’lik disposable filtreden geçirilerek mikrofiltrasyon yolu ile steril edilmiştir 109. Çalışmada patojen olarak seçilen E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria sp. Nutrient sıvı besiyerinde uygun sıcaklıkta inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden 50 µL alınarak içerisinde 50 °C’de 20 mL Muller Hinton (Merck) agar steril besiyeri bulanan petrilere aktarılmıştır. Besiyeri ve bakterilerin homojen bir şekilde karışımı sağlanmış ve besiyeri donana kadar oda sıcaklığında beklenmiştir. Besiyeri donduğunda üzerine 8 mm kalınlığında steril çubukla kuyucuklar açılmıştır ve kuyucukların tabanı steril agarla sıvanmıştır. Başlangıçta Lactobacillus suşlarından elde edilen steril süpernatantlardan 100 µL alınarak, açılan kuyucuklara aktarılmıştır. Petriler 37 °C’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. 24 saat sonunda kuyucuk çevresinde oluşan zon çapları kumpas yardımı ile milimetrik olarak ölçülmüştür 113-116. 3.2.9. Lactobacillus spp. Suşları Tarafından Üretilen Bakteriosin veya Bakteriosin Benzeri Maddelerin İnhibitör Etkisinin Belirlenmesi Lactobacillus suşlarının bakteriosin üretimleri anaerobik (jar ve CO2 kiti kullanılarak) şartlarda belirlenmiştir. Bu amaçla 16 saatlik aktif kültürlerden alınarak % 0.2 oranında glikoz içeren MRS sıvı besiyerine inokülasyon yapılarak 37 °C’de 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda, laktik asidin inhibisyon etkisini 31 gidermek için kültürlü MRS Broth’un pH’sı 1 N NaOH ile 6.5’ e ayarlanıp 5000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüjle elde edilen süpernatant 0.45 μm’lik membran filtreden geçirilerek mikrofiltrasyon yolu ile steril edilmiştir 117. Patojen bakteriler, Nutrient Broth besiyerinde uygun sıcaklıkta inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden 50 µL alınarak içerisinde 50 °C’de 20 mL Muller Hinton agar steril besiyeri bulanan petrilere aktarılmıştır. Besiyeri ve bakterilerin homojen bir şekilde karışımı sağlanmış ve besiyeri donana kadar oda sıcaklığında beklenmiştir. Besiyeri donduğunda üzerine 8 mm kalınlığında steril çubukla kuyucuklar açılmıştır ve kuyucukların tabanı steril agarla sıvanmıştır. Başlangıçta Lactobacillus suşlarından elde edilen ve pH 6.5’e ayarlanmış steril süpernatantlardan 100 µL alınarak, açılan kuyucuklara aktarılmıştır. Petriler 37 °C’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. 24 saat sonunda kuyucuk çevresinde oluşan zon çapları kumpas yardımı ile milimetrik olarak ölçülmüştür 118. 3.2.10. Lactobacillus spp. Suşlarının Kolesterol Giderimi Çalışmada düşük asitliğe ve yüksek safra tuzuna dayanıklı, safra tuzu aktivitesi yüksek, antagositik etkiye sahip L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12 ve L. fermentum2 LS-15 suşları seçilerek kolesterol giderimi çalışılmıştır. Çalışmada önceden MRS sıvı besiyeri içersine % 0.3’lük oxgall, kolik asit ve taurocholic asit ilave edilerek 121 °C’de 15 dakika süreyle otoklavda steril edilmiştir. Kolesterolü yüksek olan hastalardan alınan kan (500 mg/dl) 10000 rpm de 10 dakika santrifüj yapılarak üstte kalan sıvı kısımdan (serum) besiyerlerine (1/4 v/w) oranlarında eklenmiştir. Elde edilen karışımdan 10’ar mL alınarak steril tüplere dağıtılmıştır. Deneyler bir birinden bağımsız 2’şer paralel olarak yürütülmüştür. Daha önce hazırlanan Lactobacillus kültürlerinden 5 log10 CFU (105 CFU) dilisyondan 100 µL alınarak besi yerlerine inoküle edilmiş ve kültürler 37 °C’de 24 saat süreyle anaerob ortamda inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrasında tüpler 10000 rpm 10 dakika santrifüj edilmiş, santrifüj sonunda elde edilen süpernatant ile kolesterol miktarı enzimatik yöntemle SYNCHRON® Systems (Beckman Caulter, USA) kiti ile Unicel DxC800 model 32 otoanalizatör (Beckman Caulter, USA) cihazında saptanmıştır. Sonuçlar mg/dl’den µg/ml’ye çevrilmiştir 119. 33 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. İZOLATLARIN İDENDİFİKASYONU Bölüm 3.2.1’de anlatıldığı gibi gaitalardan elde edilen örnekler inkübe edilmiş, inkübasyon sonucunda ilk olarak koloni morfolojilerine göre bir elemine yapılmıştır. Resim. 1’de L. salivarius LS-22 suşunun 24 saatlik inkübasyon sonrasında petri kabında oluşan koloni görünümlerinin fotoğrafları verilmiştir. Resim 1: MRS Agar üzerinde 48 saat inkbasyona bırakılmış L. salivarius LS-22 suşunun Samsung S760 fotoğraf makinesi ile çekilmiş görüntüsü. Resim 1’de görüldüğü üzere kirli beyaz, beyaz ve opak koloniler alınmış, fazkontrast mikroskopta gram özelliği incelenerek, gram pozitif, basil bakteriler seçilerek numaralandırılmıştır. Resim 2’de L. pentosus LS-2 suşunun mikroskop görüntüsü verilmiştir. 34 Resim 2: L. pentosus LS-2 suşunun Olympus, CH-2 CHT model ışık mikroskobunda 100x10 büyütmede görünümü Numaralandırılan suşların idendifikasyonu API 50 CHL medium (Bio Mérieux La Bali Grottes, France) kullanılarak yapılmıştır. Yaptığımız bu çalışmada, 25 adet Lactobacillus spp. suşu izole edilmiş ve 8 farklı Lactobacillus spp. tanımlanmıştır. Gaitadan izole edilen suşların türlere göre dağılımı 11 adet L. plantarum1 (% 44), 6 adet L. fermentum2 (% 20), 3 adet L. pentosus (% 12), 1 adet L. delbrueckii subsp. delbrueckii (% 4), 1 adet L. paracasei subsp. paracasei (% 4), 1 adet L. lactis subsp lactis (% 4), 1 adet L. curvatus (% 4) ve 1 adet L. salivarius (% 4) olarak tespit edilmiştir. Suşların isim ve numaraları Tablo. 2’ de verilmiştir. Jacobsen ve ark. (1999) 120 tarafından yapılan bir çalışmada sağlıklı yetişkin ve çocuklardan alınan feçeslerde L. paracasei subsp. paracasei, L. plantarum, suşları izole edilmiştir. Moser ve Savage (2001)’ nın 121 yaptıkları bir çalışmada yetişkin ve bebek feçeslerinden L. fermentum, L. paracasei subsp. paracasei suşlarının izole edildiği bildirilmiştir. Martin ve ark. (2006) 122 tarafından yapılan başka bir çalışmada ise 1 aylık bebek feçeslerinden L. salivarius suşu izole edilmiştir. Klare ve ark. (2007) 123 tarafından yapılan insan kaynaklı Lactobacillus spp. suşlarının izole 35 edilmeye çalışıldığı bir araştırmada ise L. fermentum, L. plantarum ve L. salivarius bakterilerinin izole edildiği rapor edilmektedir. Tablo 2. Gaitadan izole edilerek tanımlanan suşların adları ve kodları SUŞ ADI SUŞ NO L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 L. pentosus LS-2 L. pentosus LS-3 L. plantarum1 LS-4 L. fermentum2 LS-5 L. plantarum1 LS-6 L. paracasei subsp. paracasei LS-7 L. plantarum1 LS-8 L. lactis subsp. lactis LS-9 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS-11 L. plantarum1 LS-12 L. pentosus LS-13 L. plantarum1 LS-14 L. fermentum2 LS-15 L. fermentum2 LS-16 L. curvatus LS-17 L. plantarum1 LS-18 L. fermentum2 LS-19 L. plantarum1 LS-20 L. plantarum1 LS-21 L. salivarius LS-22 L. plantarum1 LS-23 L. fermentum2 LS-24 L. fermentum2 LS-25 36 4.2. Lactobacillus spp. SUŞLARIN ASİT DİRENÇLİLİĞİ Lactobacillus spp. suşlarının asit dirençlilikleri Bölüm 3.2.3’te anlatıldığı şekilde tespit edilmiştir. Sonuçlar Tablo 3’te verilmiştir. Tablo 3. Lactobacillus suşlarının düşük pH (2.0, 2.5 ve 3.0) derecelerine toleransı. (24 saat sonra) Farklı pH değerleri İzolatlar 2.0 2.5 3.0 Canlı mikroorganizma sayısı (cfu/ml) L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 6x107 24x107 30x107 L. pentosus LS-2 6x107 18x107 30x107 L. pentosus LS-3 18x107 30x107 30x107 L. plantarum1 LS-4 12x107 24x107 30x107 L. fermentum1 LS-5 24x107 24x107 30x107 L. plantarum1 LS-6 18x107 30x107 30x107 L. paracasei subsp. paracasei LS-7 12x107 30x107 30x107 L. plantarum1 LS-8 12x107 30x107 30x107 L. lactis subsp. lactis LS-9 12x107 30x107 30x107 L. plantarum1 LS-10 6x107 30x107 30x107 L. plantarum1 LS-11 6x107 24x107 30x107 L. plantarum1 LS-12 18x107 24x107 30x107 L. pentosus LS-13 12x107 24x107 30x107 L. plantarum1 LS-14 18x107 24x107 24x107 L. fermentum2 LS-15 30x107 34x107 30x107 L. fermentum2 LS-16 12x107 30x107 30x107 L. curvatus LS-17 12x107 18x107 30x107 L. plantarum1 LS-18 12x107 30x107 30x107 L. fermentum2 LS-19 6x107 30x107 30x107 L. plantarum1 LS-20 30x107 30x10 30x107 L. plantarum1 LS-21 18x107 30x107 30x107 L. salivarius LS-22 15x107 24x107 30x107 L. plantarum1 LS-23 6x107 24x107 30x107 L. fermentum2 LS-24 6x107 18x107 30x107 L. fermentum2 LS-25 30x107 18x107 30x107 37 Düşük pH’ya dirençlilik probiyotik mikroorganizmalar için çok önemli bir kriterdir. Probiyotik mikroorganizmaların ince bağırsağa gelene kadar mide asitliğine yakın pH değerlerine (< 3.0) dayanabilmeleri gerekmektedir 124. Tablo 3’te de görüldüğü gibi pH değeri yükseldikçe hücrelerin canlı kalma sayılarında bir artış gözlenmektedir. Genel olarak pH 3.0 seviyesinde bütün mikroorganizmaların canlılıklarını korudukları gözlenmektedir. Yaptığımız çalışmada Lactobacillus suşlarının asit dirençleri ile ilgili elde ettiğimiz sonuçlara benzer sonuçları Prasad ve ark.’larıda (1999) 125 bulmuştur. Yapılan bu çalışmada insanlardan, süt ve süt ürünlerinden izole ettikleri Lactobacillus suşlarını pH 3.0’te 3 saat canlılıkları incelenmiştir. Sonuçta bu suşların % 80 oranında canlılıklarını koruduklarını gözlemlemişlerdir. Xanthopoulus ve ark.’nın (2000) 126 yapmış olduğu başka bir çalışmada ise, bebek feçeslerinden izole edilmiş L. acidophlus, L. gasseri, L. reuteri, ve L. rhamnosus türlerinden oluşan 20 suşun pH 3.0 de canlılıklarını %0.1-73.3 oranında korudukları belirtilmiştir. Asit dirençliliği çalışmamızda pH 2.0 değerinde ise canlı kalabilme oranlarında pH 3.0’e göre bir düşüş gözlenmektedir L. fermentum1 LS-5, L. fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 ve L. fermentum2 LS-25 suşlarının canlılıklarını diğer suşlara göre daha iyi korudukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-10, L. plantarum1 LS11, L. fermentum2 LS-19, L. plantarum1 LS-23 ve L. fermentum2 LS-24 suşlarının ise düşük pH değerlerine dirençlerinin daha zayıf olduğu tespit edilmiştir. Pereira ve Gibson (2002) 127 , insan feçesinden izole ettikleri L. fermentum KC5b suşunun pH 2’de 2 saat canlılığını sürdürebilmesi ile aside toleranslı suş olarak belirlemişlerdir. Haller ve ark. (2001) 128 tarafından yapılan bir çalışmada çeşitli kaynaklardan izole edilen Lactobacillus suşlarının pH 2.0 de canlılıkları % 093 olarak tespit edilmiştir. Bu çalışmaya göre farklı türlerin hatta aynı suşa ait türlerin, pH dirençlerinin farklı olmasının sebebi bakterilerin üreme fazındaki farklılıktan kaynaklandığı belirtilmiştir. 38 4.3. Lactobacillus spp. SUŞLARIN YÜKSEK SAFRA TUZU (OXGALL) KONSANTRASYONLARINDA DİRENÇLİLİĞİ Probiyotik mikroorganizmalar için bir diğer önemli kriter ise safra tuzlarına karşı dirençliliktir. Çünkü insan sindirim sistemine giren bakteriler midenin asit ortamından geçtikten sonra bağırsaklarda safra asitleri ve tuzları ile karşılaşırlar. Bu bakterilerin canlı kalabilmeleri açısından safra tuzu toleranslarının yüksek olması gerekmektedir 125. Değişik safra konsatrasyonlarında (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5) 3 saatlik inkübasyona bırakılan Lactobacillus suşlarının safra tuzu dirençliliği Tablo 4’te gösterilmiştir. 39 Tablo 4. Lactobacillus spp. suşlarının değişik düzeyde (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5) safra tuzu (oxgall) toleransı Farklı safra tuzu (oxgall) konsantrasyonları (%) İzolatlar 40 L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 L. pentosus LS-2 L. pentosus LS-3 L. plantarum1 LS-4 L. fermentum1 LS-5 L. plantarum1 LS-6 L. paracasei subsp. paracasei LS-7 L. plantarum1 LS-8 L. lactis subsp. lactis LS-9 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS-11 L. plantarum1 LS-12 L. pentosus LS-13 L. plantarum1 LS-14 L. fermentum2 LS-15 L. fermentum2 LS-16 L. curvatus LS-17 L. plantarum1 LS-18 L. fermentum2 LS-19 L. plantarum1 LS-20 L. plantarum1 LS-21 L. salivarius LS-22 L. plantarum1 LS-23 L. fermentum2 LS-24 L. fermentum2 LS-25 Canlı kalma oranı 0.3 1320x106 600x106 120x106 360x106 60x106 280x106 240x106 180 x106 120 x106 180 x106 180 x106 300 x106 420 x106 180 x106 720 x106 120 x106 360x106 120 x106 180 x106 %76 0.5 1.0 Canlı mikroorganizma sayısı (24 saat sonra) (cfu/ml) 420x106 240x106 6 300x10 160x106 240x106 60 x106 180 x106 120 x106 120 x106 100 x106 260 x106 200 x106 300 x106 60 x106 240 x106 60 x106 %40 %24 1.5 120x106 100x106 120x106 60 x106 160 x106 %20 Tablo 4’te de görüldüğü üzere safra tuzuna dayanıklılık açısından suşlar arasında farklılıklar bulunmaktadır. Lactobacillus suşlarının % 0.3 safra tuzu içeren ortamda canlı kalabilme oranı % 76 olmuştur. Bu oran % 0.5 safra tuzu içeren ortamda %40, %1 safra tuzu içeren ortamda % 24 ve % 1.5 safra tuzu içeren ortamda ise %20’ye düşmüştür. Bu çalışmada safra tuzuna karşı toleransı en iyi olan suşlar L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 olduğu gözlemlenmiştir. Papamanoli ve ark’nın (2003) 129 % 3.0 safra konsantrasyonunun L. sakei, L. curvatus, ve L. plantarum türlerine ait suşlar üzerinde inhibe edici etkisini araştırmışlardır. Çalışmanın sonucunda L. sakei suşları % 100, L. curvatus suşları % 42 ve L. plantarum suşları % 0 oranında inhibe edilmiştir. Yapılan bir diğer çalışmada ise L. oris AS17 ve L. fermentum AS83 suşlarının %3.0 safra tuzu içeren ortamda 4 saat süreyle safra tuzu toleransı incelenmiş, bu iki suşun % 3.0’lık safra tuzuna konsantrasyonunda canlılıklarını koruyabildikleri belirtilmiştir. Bir başka çalışmada ise, Gilliland ve Walker (1990) 130 12 adet L. acidophilus bakterisinin safra toleransını incelemiş, kültürler arasında safra toleransı bakımından önemli farklılıklar tespit etmiştir. Usman ve Hosono (1999) 131 yaptıkları çalışmada L. gasseri bakterisinin suşları arasında safra tuzları toleransı bakımından farklılıklar olduğunu belirtmişlerdir. 4.4 Lactobacillus spp. SUŞLARININ SAFRA TUZU (KOLİK ASİT) HİDROLİZİ Dekonjuge safra asitleri bağırsak florası ile sekonder safra asitlerine dönüştürülmektedir. Böylece serum kolesterol düzeyi düşemektedir. 132, 133. Bölüm 3.2.5’te safra tuzu hidrolizinin belirlenmesi üzerine yapılan araştırma sonucu elde edilen veriler Tablo 5’de sunulmuştur. 41 Tablo 5. Lactobacillus spp. suşlarının safra tuzu hidroliz (kolik asit) aktivitesi. SUŞLAR Sonuç* L. delbrueckii subsp delbrueckii LS-1 L. pentosus LS-2 L. pentosus LS-3 L. plantarum1 LS-4 L. fermentum1 LS-5 L. plantarum1 LS-6 L. paracasei subsp. paracasei LS-7 L. plantarum1 LS-8 L. lactis subsp. lactis LS-9 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS-11 L. plantarum1 LS-12 L. pentosus LS-13 L. plantarum1 LS-14 L. fermentum2 LS-15 L. fermentum2 LS-16 L. curvatus LS-17 L. plantarum1 LS-18 L. fermentum2 LS-19 L. plantarum1 LS-20 L. plantarum1 LS-21 L. salivarius LS-22 L. plantarum1 LS-23 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ + +++ +++ +++ - L. fermentum2 LS-24 L. fermentum2 LS-25 ++ + *Safra tuzu hidroliz aktivitesi **(-): Negatif, (+): Zayıf, (++): Orta, (+++): Yüksek. Tablo 5’de görüldüğü gibi suşların genelinin safra tuzunu dekonjuge edebildiği görülmektedir. Sadece suşların altı tanesi safra tuzunu hidroliz edememişlerdir. L. fermentum2 LS-15 ve L. fermentum2 LS-25 suşları ise belirli bir miktarda kolik asit hidrolizini gerçekleştirmişlerdir. Resim 3’ de hidroliz edilmemiş kolik asit kristali gösterilmiştir. Bu çalışmada en iyi sonuç veren suşlardan L. pentosus LS-2’nın gerçekleştirmiş olduğu kolik asit hidrolizi görüntüsü ise Resim 4’te verilmiştir. 42 Resim 3: Hidroliz edilmemiş kolik asit kristali. Novax AP-5 50920 binoküler mikroskobunda 20X büyütmedeki görüntüsü. Resim 4: L. pentosus LS-2 suşunun gerçekleştirdiği safra tuzu (kolik asit) hidrolizi. Kolik asit kristallerinin parçalanmış hali. Novax AP-5 50920 binoküler mikroskobunda 20X büyütmedeki görüntüsü. Moser ve Savage (2001)121, 30 tanesi insan kaynaklı, 15 tanesi süt ürünlerinden, 4 tanesi farklı kaynaklardan izole edilmiş Lactobacillus suşunun BSH 43 (Bile salt hydrolyzed) aktivitelerinin incelendiği bir çalışma yapmışlardır. Yapılan bu çalışmada suşların % 55.1 pozitif sonuç verirken, diğer %44.9 BSH aktivitelerinin negatif olduğu tespit edilmiştir. 4.5. Lactobacillus spp. SUŞLARININ ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİ Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının ampisilin (10 µg), basitrasin (10 unit), eritromisin (15 µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg) penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg), rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg), teikoplanin (30 µg), tetrasiklin (30 µg), trimetoprim (5 µg), vankomisin (30 µg), antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları NCCLS kriterlerine göre değerlendirilmiştir. Test sonuçları Tablo 6 da verilmiştir. Ayrıca %’de duyarlılık oranları Tablo 7 ve Şekil 2’de gösteriliştir. 44 Tablo 6. Gaitadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı duyarlılık sonuçları (mm). Antibiyotikler* Lactobacillus spp. 45 L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 L. pentosus LS-2 L. pentosus LS-3 L. plantarum1 LS-4 L. fermentum1 LS-5 L. plantarum1 LS-6 L. paracasei subsp. paracasei LS-7 L. plantarum1 LS-8 L. lactis subsp. lactis LS-9 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS-11 L. plantarum1 LS-12 L. pentosus LS-13 L. plantarum1 LS-14 L. fermentum2 LS-15 L. fermentum2 LS-16 L. curvatus LS-17 L. plantarum1 LS-18 L. fermentum2 LS-19 L. plantarum1 LS-20 L. plantarum1 LS-21 L. salivarius LS-22 L. plantarum1 LS-23 L. fermentum2 LS-24 L. fermentum2 LS-25 * PIP S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S B R R S S R I I S R R R S I R S R I S R I S S S R R CAZ S S S S S S S S S S S S S I S S S S S S S S S S I RA S S S S S S S S S S S S I I S S S S S S S S S S S TE S S S S I S S S S S S S S S S S I S S S S S S S S E S S S S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S S S AM S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S TEC R R S S S S S S R R R R S S R R S S R S R S R I S GM I I S I R S I I R I I I I I I I I S I I I I I I I VA R R S S S S S R R R R R S S S R S S R S I S R R S TMP R R S S R S R S S S S R R R R I R S I R R I R R R P R R S S S S S S S S S S S S S R S S R R S S S I S MEM** S S S S S S S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S=duyarlı R=dirençli I=orta duyarlı ** PIP: ampisilin (10 µg), basitrasin (10 unit), eritromisin (15 µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg) penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg), rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg), teikoplanin (30 µg), tetrasiklin (30 µg), trimetoprim (5 µg), vankomisin (30 µg), Tablo 7. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılık sonuçları. Antibiyotik Ampisilin Basitrasin Eritromisin Gentamisin Meropenem Penisilin Piperasilin Rifampin Seftazidim Teikoplanin Tetrasiklin Trimetoprim Vankomisin Duyarlı 100 36 96 12 96 76 100 92 92 52 92 32 52 Dirençli 44 8 4 20 44 56 44 Orta Duyarlı 20 4 80 4 8 8 4 8 12 4 Bu çalışmada Lactobacillus suşlarının genel olarak antibiyotiklere karşı duyarlı oldukları gözlenmiştir. Özellikle piperasilin ve ampisilin de tüm suşların duyarlı oldukları tespit edilmiştir. Bununla birlikte yaygın olarak kullanılan gentamisin, trimetoprim ve vankomisin antibiyotiklerine karşı daha dirençli oldukları görülmüştür. Lactobacillus suşlarından L. pentosus LS-3 ve L. plantarum1 LS-18 tüm antibiyotiklere duyarlı oldukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-16, L. fermentum2 LS-24 suşlarının antibiyotiklere karşı çalışmadaki diğer suşlardan daha dirençli oldukları gözlemlenmiştir. 46 % Duyarlılık Oranları 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Duyarlı Dirençli Orta Dirençli Antibiyotikler Şekil 2. Lactobacillus spp. suşlarının değişik antibiyotiklere karşı %’de duyarlılık oranları. Temmerman ve ark. (2003) 134 tarafından yapılan bir çalışmada çeşitli probiyotik ürünlerden izole edilmiş laktik asit bakterilerinin disk difüzyon yöntemi ile antibiyotik duyarlılıkları test edilmiştir. Araştırmacılar çalışma sonucunda suşların tetrasiklin ve eritromisine duyarlı olduklarını tespit etmişlerdir. Arıcı ve ark.’nın (2004) 135 probiyotik özelliğe sahip 21 Lactobacillus suşu üzerinde yapığı çalışmada, suşların tetrasikline karşı duyarlı oldukları belirtilmiştir. 4.6. Lactobacillus spp. SUŞLARIN BAZI PATOJEN MİKROORGANİZMALARA KARŞI ANTAGONİSTİK ETKİLERİ Lactobacillus suşlarının bu çalışmada kullanılan patojen mikroorganizmalara karşı genel olarak inhibisyon etkilerinin olduğu gözlemlenmiştir. Elde edilen sonuçlar Tablo 8’de gösterilmiştir. Lactobacillus suşları genel olarak patojenlere karşı inhibitör etki gösterirlerken sadece L. plantarum1 LS-18 suşunun hiçbir 47 patojende zon çapı oluşturmadığı tespit edilmiştir. Patojenler karşı inhibitör etkileri en iyi düzeyde olan suşlar ise L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS2 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS-11 L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15 L. fermentum2 LS-16, L. salivarius LS-22 olarak tespit edilmiştir. 48 Tablo 8. Lactobacillus spp. suşlarının değişik patojen bakterilerine karşı oluşturdukları antagonistik etkileri (mm). Patojen mikroorganizmalara karşı inhibisyon zonları (mm) Lactobacillus spp. 49 L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 L. pentosus LS-2 L. pentosus LS-3 L. plantarum1 LS-4 L. fermentum1 LS-5 L. plantarum1 LS-6 L. paracasei subsp. paracasei LS-7 L. plantarum1 LS-8 L. lactis subsp. lactis LS-9 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS-11 L. plantarum1 LS-12 L. pentosus LS-13 L. plantarum1 LS-14 L. fermentum2 LS-15 L. fermentum2 LS-16 L. curvatus LS-17 L. plantarum1 LS-18 L. fermentum2 LS-19 L. plantarum1 LS-20 L. plantarum1 LS-21 L. salivarius LS-22 L. plantarum1 LS-23 L. fermentum2 LS-24 L. fermentum2 LS-25 S. epidermidis P. aeruginosa K. pneumoniae E. coli Neisseria sp. 13±0.1 16±0.5 12±0.2 10±0.1 13±0.1 19±0.2 14±0.2 18±0.3 12±0.2 20±0.3 18±0.2 18±0.1 16±0.2 11±0.1 18±0.2 17±0.4 13±0.0 15±0.0 16±0.0 20±0.2 15±0.0 11±0.2 - 13±0.1 19±0.2 10±0.0 12±0.3 20±0.5 16±0.5 16±0.5 22±0.5 20±0.2 18±0.2 19±0.2 17±0.1 19±0.4 16±0.1 13±0.1 12±0.4 19±0.2 20±0.1 19±0.4 16±0.1 16±0.3 12±0.0 11±0.2 12±0.1 15±0.0 11±0.0 11±0.4 11±0.1 14±0.0 13±0.1 13±0.3 12±0.4 13±0.1 12±0.0 13±0.3 12±0.0 12±0.2 - 10±0.0 12±0.1 12±0.2 16±0.1 10±0.4 15±0.2 16±0.2 15±0.2 15±0.3 13±0.4 11±0.0 12±0.2 13±0.1 14±0.0 12±0.0 14±0.0 14±0.1 - 17±0.3 17±0.2 22±0.4 14±0.1 17±0.1 16±0.3 22±0.5 20±0.2 16±0.4 17±0.3 17±0.3 18±0.2 11±0.0 18±0.0 16±0.2 16±0.0 - 4.7. Lactobacillus BAKTERİOSİN spp. VEYA SUŞLARI TARAFINDAN BAKTERİOSİN BENZERİ ÜRETİLEN MADDELERİN İNHİBİTÖR ETKİLERİ Lactobacillus suşlarının ürettikleri laktik asit dışındaki diğer metabolitlerinin inhibitör etkilerinin belirlenmesi üzerine Bölüm 3.2.9’da anlatıldığı gibi yapılmıştır. % 0.2 glikozlu MRS sıvı besiyerinde geliştirilen Lactobacillus spp. izolatları patojen bakterilere karşı hiçbir inhibisyon etki göstermemiştir. Bu durum bize indikatör bakterilere karşı inhibisyon etkinin laktik asit bakterilerin ürettiği organik asitlerden ileri geldiğini göstermektedir. 4.8. Lactobacillus spp. SUŞLARININ KOLESTEROL GİDERİMİ Yüksek kolesterol damarları tıkayıp kalp krizlerine ve ölümlere neden olmaktadır. Laktik asit bakterilerinin kolesterolü asimile ederek serum kolesterol seviyesini düşürdüğü bilinmektedir. Araştırmada düşük asitliğe ve yüksek safra tuzuna dayanıklı, safra tuzu aktivitesi yüksek, antagositik etkiye sahip 5 suş seçilmiş ve kolesterol giderimi çalışılmıştır. Tablo 9’de ve Şekil 3’de L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12 ve L. fermentum2 LS-15 suşlarının insan plazma serumunda kolesterol giderimi görülmektedir. Besiyeri olarak MRS sıvı besi yerinde değişik safra tuzu (% 0.3 oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) ortamlarında çalışma yapılmıştır. Çalışmamızda kültürler MRS sıvı besi yerinde 10-22 µg/ml, % 0.3’lük oxgall’lı MRS sıvı besi yerinde 14-50 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit’li MRS sıvı besi yerinde 8-13.5 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit’li MRS sıvı besi yerinde 15-55 µg/ml kolesterol asimilasyonu yapmıştır. 50 Tablo 9: Bazı Lactobacillus suşlarının MRS sıvı besiyerinde ve değişik safra tuzu ( % 0.3 oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) besiyerinde kolesterol giderimi (µg/ml). Lactobacillus spp. MRS + Kollesterol MRS+ MRS + MRS + % 0.3 Oxgall + % 0.3 Kolik Asit + % 0.3 Taurocholic Asit + Kollesterol Kollesterol Kollesterol 51 L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1 10 17 9 15 L. pentosus LS-2 13 14 8 43 L. plantarum LS-11 15.5 37.5 10.5 57 L. plantarum LS-12 22 50 13.5 60 L.fermentum LS-15 21 25.5 10 55 70 60 50 MRS 40 MRS+%0,3 Oxgall MRS+%0,3 Kolik asit 30 MRS+%0,3 Taurochili asit 20 10 0 LS-1 LS-2 LS-11 LS-12 LS-15 Şekil 3. L. delbrueckii ssp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum LS-11, L. plantarum LS-12 ve L.fermentum LS-15 suşlarının kolesterol giderim miktarları (µg/ml). Gilliland ve ark. (1985) 136 çalışmalarında L. acidophilus suşlarının % 0.5 oxgall ilaveli MRS sıvı besi yerinde, ortamın plazma serum kolesterolünü 18.8-63.0 µg/ml değerinde asimilasyon yaptığını saptamışlardır. Buck ve Gilliland (1994) 137 bir çalışmada insan kaynaklı L. acidophilus suşlarının 20.5-83.3 µg/ml kolesterol asimilasyonu yaptığını göstermişlerdir. Brashears ve ark.’na (1998) 138 göre L. casei suşları MRS sıvı besi yerinde 16.9-74.3 µg/ml kolesterol asimilasyonu yapmıştır. Loing ve Shah (2005) 139 çalışmalarında Lactobacillus’ların MRS sıvı besiyerinde 10.00-21.61 µg/ml ve % 0.30 oxgall ilaveli MRS sıvı besi yerinde 12.03-32.25 µg/ml kolesterol asimile ettiğini belirlemişler. 2010 yılında yapılan başka bir çalışmada Lye ve arkadaşları Lactobacillus suşlarının MRS sıvı besi yerinde 14.22-27.89 µg/ml ve % 0.30 oxgall’lı MRS sıvı besi yerinde 11.17-62.42 µg/ml kolesterol asimile ettiklerini belirlemişlerdir 140. Araştırmamız da diğer çalışmalarla paralellik arz etmektedir. L. plantarum LS-11 MRS besi yerinde 15.5 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi yerinde da 37.5 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 10.5 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi 52 yerinde 57 µg/ml, L. plantarum LS-12 suşu MRS besi yerinde 22 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi yerinde 50 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 13.5 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 60 µg/ml ve L. fermentum LS15 suşu MRS besi yerinde 21 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi yerinde de 25.5 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 10 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 55 µg/ml kolesterol giderimi yapmıştır. Yaptığımız çalışmadan da anlaşıldığı gibi MRS sıvı besiyeri ve % 0.3’lük kolik asit katkılı MRS sıvı besi yerinde, bakterilerin kolesterol giderimi % 0.3’lük oxgall ve taurocholic asit MRS sıvı besi yerinden daha yüksek olduğu gözlenmektedir. Bu üç suşun kolesterol gideriminde kullanılabileceği belirlenmiştir. 53 5. SONUÇ VE ÖNERİLER İnsan vücudu milyarlarca mikroorganizmaya konakçılık eden bir ekosistemdir. Bu ekosistemde zararlı ve yararlı mikroorganizmalar bir rekabet halinde olup, sağlıklı insanlarda yararlı mikroorganizmalar baskın mikroflorayı oluşturmaktadır. İnsan vücudunda mikrofloranın en geniş olduğu yer ise sindirim sistemidir. Özellikle bağırsaklar yapısı ve işlevi gereği birçok mikroorganizmayı barındırmaktadır. Bağırsakların fonksiyonu insanların uzun ömürlü ve sağlıklı yaşaması için çok önemlidir. Filogenetik süreçte yararlı mikroorganizmalarla insanlar arasında mutualist bir yaşam başlamış, bu mikroorganizmalar bağırsaklara yerleşerek, bağırsak fonksiyonlarını olumlu yönde etkilemişlerdir 1-4, 15. Eski çağlarda yaşamış insanların diyetlerini göz önüne getirdiğimizde günümüz insanına göre çok daha fazla miktarda süt ürünleri ve lifli besin tükettiği görülmektedir. Bu beslenme tarzı sayesinde bağırsak mikroflorasında yararlı türler gelişmekte ve bağırsak fonksiyonları daha düzenli olmaktaydı. Dolayısıyla insanlar daha sağlıklı ve daha uzun ömürlüydüler 4, 9, 18, 25. Bu bağlamda günümüz insanının stresli yaşam tarzı, fazla miktarda rafine gıdaların tüketimi ve dengesiz beslenme, düzensiz antibiyotik kullanımı, alkol ve sigara gibi alışkanlıklar insan vücudunu olumsuz etkilediği gibi vücuda yararlı olan mikroorganizmalarında sayısını önemli ölçüde azaltmaktadır. Böylece insanlar hem direk hem de dolaylı olarak ciddi sağlık sorunlarıyla karşılaşmaktadırlar 18, 25 . Starchan tarafından ileri sürülen ‘Hijyen hipotezi’ günümüz insanının yaşadığı mikrobiyal problemlere verilebilecek güzel bir örnektir. Starchan’a göre çok steril ortamda yetiştirilen bireylerde alerjik rinit insidansının daha sık görüldüğü tespit edilmiştir. Bu hipoteze göre insanların aşırı mikrobiyol kontrolu, eskiye göre daha az insanlarla temas halinde olması (daha az kardeş sayısı ve arkadaş sayısı gibi) ve hijyen kontrollerinin iyileştirilmesi gibi etkenler insanların gastrointestinal sisteminde yerleşecek olan yararlı mikroorganizmaların gelişimini engellemektedir 141 . Bu nedenle gastointestinal sistemde azalan mikroorganizma sayısını düzenleyebilmek için probiyotik ve prebiyotik takviyeler tavsiye edilmektedir 9. 54 Yüz yılı aşkın bir süredir bazı bilim insanlarının ilgisini çeken bağırsak mikroflorası üzerine gün geçtikçe yeni araştırmalar yapılmış ve yapılmaktadır. Bu konuyla ilgili olarak en çok araştırma yapılan konu başlığı probiyotiklerdir. Günümüzde doğal ürünlere tekrar dönmeye başlayan insanlarında ilgisini çekmeyi başlamış olan probiyotikler, gastrointestinal sistem üzerinde yaşayan ve konakçıya belirgin bir yarar sağlayan mikrobiyolojik canlılardır23,30,36. Probiyotikler insan ve hayvan sağlığı üzerinde büyük faydalar sağlayan mikroorganizmalardır. Probiyotik bakteriler üzerinde son 30 yılda çok sayıda araştırmalar yapılmakta ve ülkemizde 2000’li yıllardan sonra üzerinde araştırmalar yapılmaya başlanmıştır. Ülkemizde yetişkin insanlardan izole edilen Lactobacillus bakterileri üzerinde yapılmış bir çalışma bulunmamaktadır. Aynı zamanda insan plazma serumu ile in vitro olarak kolesterol giderimi çalışması da yapılmamıştır. Bu çalışmada, yaşları 25-50 arasında değişen sağlıklı insanların intestinal sistemine ait 25 adet Lactobacillus spp. suşları üzerinden yürütülmüştür. Suşların düşük asit ve yüksek safra tuzu (oxgall) tölarensları, safra tuzu (kolik asit) hidroliz aktiviteleri, antibiyotik dirençleri, antagonistik etkileri, ve bu suşlar tarafından üretilen bakteriosin veya bakteriosin benzeri ürünlerin inhibitör etkileri gibi probiyotik özellikler yönünden değerlendirilmiştir. Ayrıca L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. Plantarum1 LS-11, L. Plantarum1 LS-12 ve L. Fermentum2 LS-15 suşları seçilerek kolesterol giderimlerine bakılmıştır. Probiyotik mikroorganizmalar bağırsaklarda lokalize olduklarına göre doğal olarak gastrointestinal sistemin şartlarına uyum sağlamaları gerekmektedir. Bu nedenle öncelikli olarak yüksek asitli ortamlara dirençli olmaları gerekmektedir. Yapmış olduğumuz üç değişik düşük pH çalışmasında; pH 3 değerinde bütün suşlarımızın canlılığını korudukları gözlemlenmiştir. pH 2.0 değerinde ise canlı kalabilme oranlarında pH 3.0’e göre bir düşüş gözlenmektedir L. fermentum1 LS-5, L. fermentum2 LS-15, L. plantarum1 LS-20 ve L. fermentum2 LS-25 suşlarının canlılıklarını diğer suşlara göre daha iyi korudukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-10, L. plantarum1 LS11, L. fermentum2 LS-19, L. plantarum1 LS-23 ve L. fermentum2 LS-24 suşlarının 55 ise düşük pH değerlerine dirençlerinin daha zayıf olduğu tespit edilmiştir (Bkz. Tablo 3). Gastrointestilal sistemin ağır şartlarından, düşük pH’ın yanı sıra, bir diğer faktörde bilindiği üzere yüksek safra tuzu yoğunluğudur. Probiyotik mikroorganizmalarda aranan özelliklerden başlıcalarıdan olan safra tuzu dirençliliği ile ilgili olarak suşlarımızla yapmış olduğumuz değişik safra tuzu konsantrasyonlardaki (% 0.3, % 0.5, % 1.0 ve % 1.5) çalışmalarımızda, doğal olarak tuz yoğunluğu yükseldikçe canlı kalma oranlarında azalma olduğu gözlemlenmektedir (% 0.3 safra tuzunda % 76 iken % 1.5 safra tuzunda % 20). Sonuç olarak safra tuzuna karşı toleransı en iyi olan suşlar L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15, L. fermentum2 LS-16 olduğu gözlemlenmiştir (Bkz. Tablo 4). Safra tuzu toleransı ile ilgili olarak bir diğer çalışmamız olan, safra tuzu hidrolizinde elde ettiğimiz sonuçlar da ise suşlarımızın genelinin safra tuzunu dekonjuge edebildiği görülmektedir. Dekonjuge safra asitleri bağırsak florası ile sekonder safra asitlerine dönüştürülmektedir. Böylece serum kolesterol düzeyi düşemektedir. Serum kolesterol seviyesini düşürme özelliğinin bulunması Probiyotiklerin yararları konusunda aranan bir özelliktir. Bu çalışmamızda, sadece altı suşumuz safra tuzunun hidrolizini gerçekleştirememiştir. L. fermentum2 LS-15 ve L. fermentum2 LS-25 suşlarımız ise belirli bir miktarda kolik asit hidrolizini gerçekleştirmişlerdir. Çalışmada en iyi sonuç veren suşumuz L. pentosus LS-2’dir (Bkz. Tablo 5 ve Resim 4). Probiyotik mikroorganizmalar gastrointestinal sistemin şartlarına dirençli olmalarının yanı sıra dışarıdan gelebilecek etkenlere karşıda dirençli olmaları gerekmektedir. Bu konuyla ilgili olarak yaptığımız antimikrobiyal aktivite çalışmasında; suşlarımızın, ampisilin (10 µg), basitrasin (10 unit), eritromisin (15 µg), gentamisin (10 µg), meropenem (10 µg) penisilin (10 unit), piperasilin (100 µg), rifampin (5 µg), seftazidim (10 µg), teikoplanin (30 µg), tetrasiklin (30 µg), trimetoprim (5 µg), vankomisin (30 µg), antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları araştırılmış, genel olarak suşlarımızın bu antibiyotiklere karşı duyarlı oldukları gözlemlenmiştir. Özellikle piperasilin ve ampisilin de tüm suşların duyarlı oldukları 56 tespit edilmiştir. Bununla birlikte yaygın olarak kullanılan gentamisin, trimetoprim ve vankomisin antibiyotiklerine karşı daha dirençli oldukları görülmüştür. Suşlarımızdan L. pentosus LS-3 ve L. plantarum1 LS-18 tüm antibiyotiklere duyarlı oldukları tespit edilmiştir. L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2, L. plantarum1 LS-11, L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-16, L. fermentum2 LS-24 suşlarımız, diğer suşlarımıza göre daha dirençli oldukları gözlemlenmiştir. Probiyotik mikroorganizmalar gastrointestinal sistemde patojen mikroorganizmalarla rekabet içindedirler. Burada yaşayabilmeleri için patojen mikroorganizmalara karşı antagonistik etki özelliklerinin olması gerekmektedir. Bu özellikten yola çıkarak suşlarımız üzerinde yaptığımız çalışmada, 5 adet patojen mikroorganizma kullanılmıştır. Bunlar: E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27853), K. pneumoniae (ATCC 25656) S. epidermidis (ATCC 12228) ve Neisseria sp.’dir. Suşlarımızın bu çalışmada kullanılan patojen mikroorganizmalara karşı genel olarak inhibisyon etkilerinin olduğu gözlemlenmiştir. Sadece L. plantarum1 LS-18 suşumuz hiçbir patojende zon çapı oluşturmadığı tespit edilmiştir. Patojenlere karşı inhibitör etkileri en iyi düzeyde olan suşlarımız ise L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS-1, L. pentosus LS-2 L. plantarum1 LS-10 L. plantarum1 LS11 L. plantarum1 LS-12, L. fermentum2 LS-15 L. fermentum2 LS-16, L. salivarius LS-22 olarak tespit edilmiştir. Bu çalışmaya paralel olarak yürüttüğümüz bakteriosin veya bakteriosin benzeri maddelerin inhibitör etkilerinin tespiti amacıyla yaptığımız çalışmada, suşlarımızın ürettikleri laktik asit dışındaki diğer metabolitlerinin inhibitör etkilerinin belirlenmesi üzerine % 0.2 glikozlu MRS sıvı besiyerinde geliştirilen suşlarımızdan elde edilen supernatantlar, patojen bakterilere karşı hiçbir inhibisyon etki göstermemiştir. Bu durum bize indikatör bakterilere karşı inhibisyon etkinin laktik asit bakterilerin ürettiği organik asitlerden ileri geldiğini göstermektedir. Yaptığımız bu çalışmaların sonuçlarından yola çıkarak probiyotik özellikleri bakımından iyi sonuç veren düşük asitliğe ve yüksek safra tuzuna dayanıklı, safra tuzu aktivitesi yüksek, antagositik etkiye sahip, L. delbrueckii subsp. delbrueckii LS1, L. pentosus LS-2, L. plantarum LS-11, L. plantarum LS-12 ve L. fermentum LS-15 suşlarımız alınarak, kolesterol giderimleri araştırılmıştır. Daha önceki bölümlerde de 57 bahsedildiği gibi kolesterol giderimi probiyotikler içinde aranan bir özellik olmuştur. Yüksek kolesterol damarları tıkayıp kalp krizlerine ve ölümlere neden olmaktadır. Laktik asit bakterilerinin kolesterolü asimile ederek serum kolesterol seviyesini düşürdüğü bilinmektedir. Besiyeri olarak MRS sıvı besi yerinde değişik safra tuzu (% 0.3 oxgall, kolik asit ve taurocholic asit) ortamlarında çalışma yapılmıştır. En yüksek kolesterol giderimini L. plantarum LS-12 suşu MRS besi yerinde 22 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi ortamında 50 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 13.5 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 60 µg/ml olarak vermiştir. L. plantarum LS-11 MRS besi yerinde 15.5 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi ortamında 37.5 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 10.5 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 57 µg/ml ve L. fermentum LS15 suşu MRS besi yerinde 21 µg/ml, % 0.3’lük oxgall MRS besi ortamında 25.5 µg/ml, % 0.3’lük kolik asit 10 µg/ml ve % 0.3’lük taurocholic asit MRS besi yerinde 55 µg/ml kolesterol giderimi yapmıştır. Kolesterol giderimi yüksek olan bu üç suşun potansiyel probiyotik olabileceklerine karar verilmiştir. Bu suşlar başka araştırmalarda kullanılmak üzere muhafazaya alınmıştır. Sonuç olarak, sağlıklı bir yaşam için gastrointestinal sistemin düzenli çalışması elzemdir. Bu sistemin düzenli bir şekilde çalışabilmesi için probiyotikler en iyi yardımcılardır. İnsan doğumundan itibaren bağırsak florası oluşmaya başlamaktadır. Doğumdan sonraki dönem anne sütü kullanımı, bebeğin bulunduğu ortam gibi etkenler bağırsak mikroflorasını belirlemektedir. İnsanlığın başlangıcında her şey doğaldı ve kendiliğinden gerçekleşmekteydi. Günümüze baktığımızda insanoğlunun hemen her şeyde müdahalesinin olduğunu görmekteyiz. Örneğin doğumun sezaryan olması, doğumdan sonra anne sütünün kullanılmaması ve bebeğin aşırı steril ortamda yetiştirilmesi, bireyin gastointestinal mikroflorasının daha temelden olumsuz bir şekilde teşekkül etmesine neden olur. Birey büyüdükçe günümüz şartlarında var olan dengesiz beslenme, gereksiz antibiyotik kullanımı, sigara ve alkol kullanımı, rafine gıdaların tüketimi ve stresli yaşam tarzı, başlangıçta oturmamış olan gastrointestinal florayı daha da olumsuz etkilemektedir. Bu nedenle günümüzde de şahit olduğumuz bir takım doğrudan ve dolaylı birçok hastalıkla muhatap olmaktayız. Bu nedenlerle sağlıklı bir yaşam ve hastalıkların tedavisinde 58 probiyotik mikroorganizmaların yeri tartışılmaz hale gelmektedir. Probiyotiklerle ilgili yapılan çalışmalara bakıldığında birçok hastalıktan korunmada ve tedavisinde kullanıldığı görülmektedir. Ancak sadece probiyotik takviyesi almak, gastrointestinal sistem için yeterli olmayacaktır. Sağlıklı yaşam için en baştan duyarlı olunması gerekmektedir ve öncelikli olarak bireylerin normal doğumla dünyaya gelmesi ve sonrasında anne sütü kullanımı teşvik edilmelidir. Sonrasında bireyler günlük yaşamlarında diyetlerine dikkat etmeli rafine gıdalardan uzak durmalıdırlar. Gereksiz antibiyotik kullanımı ve zararlı alışkanlıklardan kaçınmalıdırlar. Gasrointestinal floradaki probiyotikler için diyetlerinde mutlaka prebiyotik içeren besinleri tüketmeleri gerekmektedir. Günümüzde bunları yapmak zor olsa da herhangi bir hastalık karşısında harcanan maddi güç ve zaman göz önüne alındığında daha kolay olduğu aşikardır. 59 6. KAYNAKÇA 1. Klaenhammer, R. T. ; Kullen, J.M. Int. J. of Food Microbiol, 1999, 50, 45-57. 2. Rolfe, R. D. J. of Nutrition, 2000, 130, 3965-4025. 3. Çakır, İ. Lactobacillus Ve Bifidobacterlerde Bazı Probiyotik Özelliklerin İncelenmesi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, Ankara, 2003. 4. Can, Ö. P. Doğu Anadolu Bölgesi Araştırmaları, 2007, 107-110. 5. Karaçay, B. Bilim Ve Teknik Dergisi, 2010, 514, 36-43. 6. Peter, J. T. ; Ruth, E. L. ; Michael, A. M. ; Vincent, M. ; Elaine, R. M. ; Jeffrey, I. G. Nature Publishing Group, 2006, 1027-1031. 7. Young, R. J. ; Huffman, S. J. Pediatr Health Care, 2003, 17, 277-283. 8. Guarner, F. ; Malagelada J. R. Lancet, 2003, 360, 512-519. 9. İnanç, N. ; Şahin, H. ; Çiçek, B. Erciyes Tıp Dergisi, 2005, 27 (3), 122-127. 10. Morelli, L. J. Nutr. 2008, 138,1791-1795. 11. Caicedo, R. A. ; Schanler, R.J. ; Li, N. ; Neu, J. Pediatr Res, 2005, 58, 625–628. 12. Gültekin, M. Ankem Dergisi, 2004, 18 (Ek 2), 87-89. 13. Yan, F. ; Polk, D. B. Curr Opin Gastroenterol, 2004, 20, 565–571. 14. Gill, H. S. ; Guarner, F. Postgrad Med J, 2004, 80, 516–526. 15. Coşkun T. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 2006, 49, 128-148. 16. Quigley, E. M. M. Pharmacological Research, 2010, 61, 213-218. 17. Thomas, D. W. ;Greer, F. R. Pediadrics, 2010, 126, 1217-1231. 18. Özden, A. Güncel Gastroloji, 2005, 9/3, 124-133. 19. Maukonen, J. ; Mattö, J. ; Suihko M-L. ; Saarela, M. Journal of Medical Microbiology, 2008, 57, 1560–1568. 20. Gibson, G. R. ; Roberfroid, M. B. J Nutr, 1995, 125, 1401-1412. 21. Can, Ö. P. Doğu Anadolu Bölgesi Araştırmaları, 2007, 194-196. 22. Yaşar, B. ; Kurdaş, O. Ö. Güncel Gastroloji, 2009, 13/1, 23-28. 23. Gürsoy, O. ; Kınık, Ö. Mühendislik Bilimleri Dergisi, 2006, 12, 105-116. 24. Bengmark, S. Gastroenterol Clin North Am, 2005, 34, 413-436. 60 25. Parracho, H. ; McCartney, A. L. ; Gibson, G. R. Proceedings of the Nutrition Society, 2007, 66, 405–411. 26. Sinkiewicz, G. Lactobacillus reuteri in health and disease, Doktora Tezi, Malmö University Faculty of Health and Society Department of Biomedical Laboratory Sciences, Holmbergs, Malmö, 2010. 27. Soccol, C. R. ; Vandenberghe, S. L. P. ; Spier, M. R. ; Medeiros, A. B. P. ; Yamaguishi, C. T. ; Lindner, J. D. ; Pandey, A. ; Soccol, V. T. Food Technol. Biotechnol, 2010. 48 (4) 413–434. 28. Rosenberg, I. Z. ; Rosenberg, E. J. Microbial Biochem Technol, 2011, S1. 29. Özden, A. Güncel Gastroenteroloji, 2006, 10/3, 273-278. 30. Sullivan A. ; Nord, C. E. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2002, 50, 625–627. 31. Probiotics: Review and Outlook, 3rd International Convention, Paris, 2nd and 3rd December 2004. 32. Özen, M. Probiyotikler: anlatılmayan Tarihçe Nobel tıp kitap evleri, 2011, 1-15 33. Gürsoy, O. ; Kınık, Ö. Ege Üniv. Ziraat Fak. Derg., 2006, 43(1), 181-188. 34. Rusch, V. Probiotics: Bacteria And Bacterial Fragments As Immunomodulatory Agents, 2001 Old Herborn University Seminar No. 15, 2002. 35. Fuller, R. Journal of Applied Bacteriology, 1989, 66, 365-378. 36. Gürbüz, H. İnsan Kaynaklı Lactobacillus spp. Suşlarında Agregasyonun Probiyotik Önemi, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstirüsü, Ankara, 2004. 37. Kopp-Hoolihan, L. J Am Diet Assoc, 2001; 101: 229-238. 38. Doron, S. ; Snydman, D. R. ; Gorbach, S. L. Gastroenterol Clin North Am, 2005, 34: 483-498. 39. Gionchetti, P. ; Lammers, K. M. ; Rizzello, F. ; Campieri, M. Gastroenterol Clin North Am, 2005, 34: 499-513. 40. Çelen, E. ; Hız, I. ; Vural, T. Güncel Gastroloji Dergisi, 1999; 403-405. 41. Önal, D. Bazı laktik asit bakterilerinin probiyotik özelliklerinin araştırılması. Yüksek lisans tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstirüsü, Ankara, 2005. 42. Gülmez, M. ; Güven, A. Kafkas üniv. Vet. Fak. Derg., 2002, 8(1): 83-89. 61 43. Donnet-Hughes, A. ; Rochat, F. ; Serrant, P. ; Aeschlimann, J. M. ; Schıffrın, J. J Dairy Sci, 1999, 82, 863–869. 44. Gibson, G. R. ; Fuller, R. American Society for Nutritional Sciences, 2000, 391395. 45. Uncello, M. ;Malaguarena G, Basile. F. , BMC Surg. 2012, 12 1, 35. 46. Senok, A. C. ; Ismaeel, A. Y. ; Botta, G. A. Clin Microbiol Infect, 2005, 11, 958-966. 47. Hill, H. S. ; Guarner, F. Postgrad Med J, 2004, 80, 516-526. 48. Penner, R. ; Fedorak, R. N. ; Madsen, K. L. Curr Opin Pharmacol, 2005, 5, 1-8. 49. Hoyos, A. B. Int. J. Infect Dis., 1999, 3, 197-202. 50. Erdeve, O. ; Tiras, U. ; Dallar, Y. ; Savaş, S. Aliment Pharmacol Ther, 2005, 21, 1508-1509. 51. Felley, C. ; Michetti, P. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2003, 17, 785-91. 52. Hamilton-Miller, J. M. Int J. Antimicrob Agents, 2003, 22, 360-366. 53. Commane, D. ; Hughes, R. ; Shortt, C. ; Rowland, I. Mutation Res., 2005, 591, 276-289. 54. Kampman, E. ; Goldbohm, R. A. ; Van Den Brandt, P. A. Cancer Res., 1994, 54, 3186-3190. 55. Mohan, J. C. ; Arora, R. ; Khalilullah, M. Indian Heart J. 1990, 42, 361-364. 56. Belviso, S. ; Giordano, M. ; Dolci, P. ; Zeppa, G. Dairy Sci. Technol., 2009, 89, 169–176. 57. Isolauri, E.at all Am. J. Clin. Nutr.2001, 73 (suppl), 444-450. 58. Vanderhoof, J. A. ; Young, R. J. Ann Allergy Asthma Immunol, 2004, 93, (Suppl 3), 33-37. 59. Penra, F. J. ; Filho, L. A. ; Calsada, A. C. ; Junior, H. ; Nicloi, J. R. J. Pediatr, 2000, 76, (Suppl 2), 209. 60. Roberfroid, M. B. Am. J. Clin. Nutr., 2000, 71, (supp l), 1682–1687. 61. Klaenhammer, R. T. J. Nutr., 2000, 130, 415-416. 62. Gibson, G. R. Clin Nutr., 2004, 1, (Supp l), 25-31. 63. Langlands, S. J. ; Hopkins, M. J. ; Coleman, N. ; Cummings, J. H. Gut, 2004, 53, 1610-1616. 62 64. Brannon, C. Prebiotics: feeding friendly bacteria. Today’s Dietitian September 2003. 65. Yağcı, R. Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Dergisi, 2002, 45(4), 337-344. 66. Manning, T. S. ; Gibson, G. R. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol, 2004, 18, 287-298. 67. Rastall, R. A. ; Maitin, V. Curr Opin Biotechnol, 2002, 13, 490-496. 68. Peitsudou,K. ; karantanos, T. ; Theodoropoulos, G.E. Dig Sung. 2012, 29(5), 426-428. 69. Daeschel, M. A. Food Technol., 1989, 164-167. 70. Tunail, N. Mikrobiyoloji, Pelin ofset, Ankara, 2009. 71. Tunail, N. ; Köşker, Ö. Süt Mikrobiyolojisi, A. Ü. Ziraat Fak., Ankara, 1989. 72. Yetişmeyen, A. Süt Teknolojisi, A. Ü. Ziraat Fak., Ankara, 1995. 73. Arda, M. Genel Bakteriyoloji, A. Ü. Vet. Fak., Ankara, 1985. 74. Sneath, P. H. A. ; Mair, N. S. ; Sharpe, M. E. ; Holt, J.G. Bergey’s Manuel of Systematic Bacteriology, Williams&Wilkins, London, 1986. 75. Ambrosini, V. M. ; Gonzales, S. ; Holgado, A. P. R. ; Oliver, G. J. Food Prot., 1998, 61 (5), 557-562. 76. Drinan, D. F. ; Tobin, S. ; Cogan, T. M. Applied And Environmental Microbiology, 1976, 481-486. 77. Prescott, C. S. ; Dunn, G. C., Industrial Microbiology, Published on Distributors, Delhi, India, 1987. 78. Tekinşen, O. C. ; Atasever, M. Süt Ürünleri Üretiminde Starter Kültür, Selçuk Ü. Vet. Fak. Yayınları, Konya, 1994. 79. Halkman, K. Tarım Mikrobiyolojisi, A. Ü. Ziraat Fak., Ankara, 1991. 80. Aslım, B. ; Beyatlı, Y. ; Halkman, K. Türk J. Biol., 2000, 24, 65–78. 81. Çetin, E. T. Endüstriyel Mikrobiyoloji, İ. Tıp Fak. Yayınları, İstanbul, 1983. 82. Üçüncü, M. Süt Ve Mamulleri Teknolojisi, İzmir, 2005. 83. Con, A. ; Gökalp, H.Y., Türk Mikrobiyol. Cem Derg., 2000, 30, 180-190. 84. Evren, M. ; Albayram, C. ; Apan, M. Laktik Asit Bakterilerinin Oluşturduğu Antimikrobiyel Maddeler, Türkiye 9. Gıda Kongresi; 24-26 Mayıs 2006, Bolu, 977-980. 85. Dahiya, R. S. ; Speck, M. L. J. Dairy Sci. 1968, (51), 1568. 63 86. Juven, B. J. ; Schved, F. ; Lindner, P. Journal of Food Protection, 1992, 55, (3), 157-161. 87. Carminati, D. ; Giraffa, G. ; Bossi, M. G. J. Food Protect, 1988, 52, (9), 614617. 88. Kognoff, M. F. Gastroenterology, 1993, (105), 1275. 89. Rautava, S. ;Walker, W. A. Curr. Gastroenterol rep., 2007, 9, 385-392. 90. Kayser, F. H. ; Bienz, K. A. ; Eckert, J. ; Zinkernagel, R. M. Tıbbi Mikrobiyoloji, Nobel Tıp Kitap Evi, 2002. 91. Erkmen, O. Gıda Mikrobiyolojisi, Efil Yayın Evi, Ankara, 2010. 92. Demirbağ, Z. Genel Mikrobiyoloji, Karadeniz Tek. Üni. Fen Edb. Fak. Biyoloji Bölümü, Trabzon, 2006. 93. Ustaçelebi, Ş. Temel Ve Klinik Mikrobiyoloji, Güneş Kitap Evi. 1999. 94. Özden, S. Klinik Örneklerden İzole Edilen Klebsiella Pneumoniae Türlerinde Genişletilmiş Spektrumlu Beta-Laktamaz Varlığının Moleküler Tekniklerle Araştırılması, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 2007. 95. Kulacaoğlu, N. Klinik Örneklerden İzole Edilen Pseudomonas Aeruginosa Suşlarında Hücre Yoğunluğunun Farklı Yüzeylere Tutunmadaki Etkisi, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 2006. 96. Man, J. C. ; Ragosa, M. ; Sharpe, M. E. A. J. Appl. Bact., 1960, 23, 130-138. 97. Cruikshank, R. Med. Microbiol, 11th Edition Livingstone, London, 1972. 98. Ronald, M. ; Lawrence, A. ; Park, C. Handbook of Microbiology, 2th Edition, CRC Press, New York, 1997. 99. Swenson, J. M. ; Facklam, R. R. ; Thornsberry, C. Antimicrobial Agents And Chemotherapy, 1990, 543-549. 100.Hyronimus, B. ; Le Marrec, C. ; Sassi A. H. ; Deschamps, A. International Journal of Food Microbiology, 2000, (61), 193–197. 101.Iyer, C. ; Kailasapathy, K. Journal of Food Science, 2005, 70, (1), 18-23. 102.Begley, M. ; Hill, C. ; Gahan, C. G. M. Applied And Environmental Microbiology, 2006, 1729–1738. 103.Felten, A. ; Bareau, C. ; Bizet, C. ; Lagrange, P. H. ; Philippon A. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 729-733. 64 104.Yun, J. H. ; Yim, D. S. ; Kang, J.Y. ; Kang, B. Y. ; Shin, E. A. ; Chung, M. J. ; Kim, S. D. ; Baek, D. H. ; Kim, K. ; Ha, N. J. Arch Pharm Res., 2005, 28(6), 660-666. 105.Moroni, O. ; Kheadr, E. ; Boutin, Y. ; Lacroix, C. ; Fliss, I. Appl. Environ. Microb., 2006, 72, 6894-6901. 106.Chou, L. ; Weimer, B. J. Dairy Sci., 1999, 82, 23–31. 107.Liong, M. T. ; Shah, N. P. J. Dairy Sci., 2005, 88, 55–66. 108.Pereira, D. I. A. ; Mccartney, A. L. ; Gibson, G. R. Applied And Environmental Microbiology, 2003, 4743–4752. 109.Şimşek, Ö. ; Çon, A. H. ; Tulumoğlu, Ş. Food Control, 2006, 17, 263-270. 110.Salminen, M. K. ; Rautelin, H. ; Tynkkynen, S. ; Poussa, T. ; Saxelin, M. ; Valtonen V. ; Järvinen, A. Clin. Infect. Dis., 2006, 42:35-44. 111.Charteris, W. P. ; Kelly, P. M. ; Morelli, L. ; Collins, J. K.. J. Food Protect, 1998, 61, 1636-1643. 112. Avonts, L. ; De-Vuyst, L. Gent., 2001, 66, 543-545. 113. Ashraf, M. ; Arshad, M. ; Siddique M. ; Muhammad, G. Pakistan Vet. J., 2009, 29, (4), 186-190. 114.Harris, C. J. ; Deschell, M. A. ; Stiles, M. E. ; Klaenhammer, T. R. J. Food. Protect., 1989, 52: 384-387. 115.Forestier, C. ; De Champs, C. ; Vatoux, C ; Joly, B. Res. Microbiol., 2001, 152, 167-173. 116.Kaur, I. P. ; Chopra, K. ; Saini, A. Eur. J. Pharma Sci., 2002, 15, 1-9. 117. Stewart, L. ; Pellegrini, C. A. ; Way, L.W. Surg. Forum, 1986, 37, 157-159. 118.Klayraung, S. ; Okonogi, S. Brazilian Journal of Microbiology, 2009, 40, 757766. 119.Ziarno, M. Acta Sci. Pol. Technol. Aliment., 2007, 6(2), 29-40. 120.Jacobsen, C. N. ; Nielsen V. R. ; Hayford, A. E. ; Moller, P. L. ; Michaelsen, K. F. ; Pærregaard, A. ; Sandström, B. ; Tvede, M. ; Jakobsen, M. Applied And Environmental Microbiology, 1999, 4949–4956. 121.Moser, S. A. ; Savage, D. C. Applied And Environmental Microbiology, 2001, 3476–3480. 65 122.Martín, R. ; Jiménez, E. ; Olivares, M. ; Marín, M. L. ; Fernández, L. ; Xaus, J. ; Rodríguez, J. M. International Journal of Food Microbiology, 2006, 112, 35-43. 123.Klare, I. ; Konstabel, C. ; Werner, G. ; Huys, G. ; Vankerckhoven, V. ; Kahlmeter, G. ; Hildebrandt, B. ; Müller-Bertling, S. ; Witte, W. ; Goossens, H. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2007, 59, 900–912. 124.Tuomola, E. ; Crittenden, R. ; Playne, M. ; Erika, I. ; Salminen, S. Am. J. Clin. Nutr., 2001, 73, 393–39S. 125.Prasad, J. ; Gill, H. ; Smart, J. ; Gopal, P. K. İnt. Dairy Journal, 1998, 993– 1002. 126.Xanthopoulos, V. ; Petridis D. ; Tzanetakis, Food Microbiology and Safety, 2001, 66(5), 747-752. 127.Pereira, D. I. A. ; Gibson, G. R. Applied And Environmental Microbiology,. 2002, 4689–4693. 128.Haller, D. ; Colbus, H. ; Gänzle, M. G. ; Scherenbacher, P. ; Bode, C. ; Hammes W. P. Systematic and Applied Microbiology, 2001, 218–226. 129.Papamanoli, E. ; Tzanetakis, N. ; Litopoulou-Tzanetaki, E. ; Kotzekidou, P. Meat Science, 2003, 859–867. 130.Gilliland, S. E. ; Walker, D. K. Journal of Dairy Science, 1990, 905–911. 131.Usman, U. ; Hosono A. J. Dairy Sci., 1999, 82, 243–248. 132.Sanders, M. E. Journal of Nutrition, 2000, 130, 384–390. 133.Bongaerts, G. ; Bakkeren, J. ; Severijnen, R. ; Sperl, W. ; Willems, H. ; Naber, T. ; Wevers, R. ; Van Meurs, A. ; Tolboom, J. J. Pediatr Gastroenterol Nutr., 2000, 30(3), 288-93. 134.Temmerman, R. ; Scheirlinck, I. ; Huys, G. ; Swings, J. Applied And Environmental Microbiology, 2003, 220–226. 135.Arıcı, M. ; Bilgin, B. ; Sağdıç, O. ; Özdemir, C. Food Microbiology, 2004, 21, 19-24. 136.Gilliland, S. E. ; Nelson, C. R. ; Maxwell, C. Appl. Environ. Microbiol., 1985, 49, 377-381. 137.Buck, L. M. ; Gilliland, S. E. Journal of Dairy Science, 1994, 77 (10) 29252933. 66 138.Brashears, M. M. ; Gilliland, S. E. ; Buck, L. M. Journal of Dairy Science, 1998, 81(8), 2103-2110. 139.Liong, M. T. ; Shah, N. P. J. Dairy Sci., 2005, 88, 55-66. 140.Lye, H. S. ; Ali, G. R. R. ; Liong, M. T. International Dairy Journal, 2010, 20, 169-175. 141.Starchan, D.P. Thorax 2000 55(1), 2-10. 67