kanser kök hücreleri paradigması

Doç. Dr. Meltem DEMİREL KARS
Selçuk Üniversitesi
İleri Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi
& Sarayönü MYO
27. Ulusal Biyokimya Kongresi, 3-6 Kasım 2015, Antalya
Kemoterapi,
yöntemdir.
kanser
tedavisinde
uygulanan
en
yaygın
Ancak kemoterapi süresince, hastaların tedaviye cevap
vermemesi veya tedavi sonrası kanserin tekrarlaması sıklıkla
görülen bir durumdur.
Sonradan kazanılan ya da tedavi öncesi kişide varolan ilaç
dirençliliği, kanser kemoterapisinde başarıya ulaşmayı büyük
ölçüde engellemektedir. Bu duruma “çoklu ilaç dirençliliği”
(ÇİD, multiple drug resistance; MDR) denilmektedir.
MULTIDRUG RESISTANCE IN CANCER
Three decades of multidrug-resistance research have identified a myriad of ways in
which cancer cells can elude chemotherapy, and it has become apparent that
resistance exists against every effective drug, even our newest agents.
Michael M. Gottesman
Hücrelerdeki, zararlı ve toksik maddeleri uzaklaştıran
biyokimyasal sistemlerin olduğu bilinmektedir. İlaç
tedavileri sırasında bu sistemlerin güçlendiği ve
kemoterapötik ilaçların etkili bir şekilde hücre dışına
atıldığı görülmüştür.
Çoklu ilaç dirençliliğine sebep olan mekanizmalardan
bazıları, ABC taşıyıcı gen ailesi proteinlerinin
ekspresyonlarındaki artış, hücreleri programlanmış ölüme
(apoptoz) götüren yolaklardan bazılarının bloke olması ve
ilaç hedef moleküllerindeki değişimlerdir.

İlacın hücre dışına atılmasındaki artış ve dolayısıyla
hücre içi ilaç konsantrasyonunun azalması ilaca
dirençlilik kazanılmasında etken mekanizmalardan en
önemlisidir.
ABC Taşıyıcı Protein Ailesi

Normal hücrelerde, zararlı
uzaklaştıran proteinlerdir.

Bu proteinler, hücre zarında bulunan ve ATP kullanarak
özgün
substratları
hücre
dışına
pompalayan
proteinlerdir.
ve
toksik
maddeleri
MDR1; P-gp
ABCB1
MRP1
ABCC1
BCRP
ABCG2
Geçici dirençlilik (Temporary):
İlaç metabolizmasının ve hücre içi kinetiğin
geçici olarak değişmesi,
Kalıcı dirençlilik (Permanent):
Kalıcı olarak genetik değişiklik,
Doğal/kendinden dirençlilik (Intrinsic):
İlaç uygulamasından önce var olan dirençlilik,
Kazanılan/Gelişen dirençlilik (Acquired):
İlaç uygulamasından sonra gelişen dirençlilik.
Gupta et al. (2009)
Established breast cancer therapies often fail to achieve
long-term patient survival, possibly because of tumor
relapse as a result of chemotherapy resistant
mammary cancer stem cells.
Thus, new therapeutic strategies to specifically target
these cancer stem cells are urgently required.




Prof. Max Wicha; kanser kök hücreleri paradigması
FIRST, cancers originate in tissue stem or progenitor cells through
dysregulation of the self-renewal process,
SECOND, throughout tumorigenesis, CSCs drive tumor growth,
THIRD, current chemotherapeutic agents and radiation therapy
largely target proliferating and differentiated cells that form the bulk
of the tumor but not the relatively quiescent CSCs. Also, SCs are
drug resistant and CSCs appear to be so too. Thus, this quiescence
and resistance may account for many treatment failures,
FOURTH, if this is the case, then the only effective way to treat
cancer is to target the CSC population.
M.S. Wicha, S. Liu, G. Dontu
Cancer stem cells: an old idea—a paradigm shift
Cancer Res, 66 (2006), pp. 1883–1890.
Bu durumda hedef kanser kök hücreleri olmalı.
Eğer bir terapi yöntemi tümör hücrelerinin pek çoğunu
öldürdüğü halde kanser kök hücrelerini geride
bırakıyorsa, tümör yeniden ortaya çıkabilecektir.
KKH (CSC)
 Kendini yenileyebilirler,

Tümörü meydana getiren heterojen hücre popülasyonu oluşturabilir,

Tümör oluşturan/tumorigenic hücrelerdir,

Tümör içerisinde küçük bir popülasyonu oluştururlar,

Daha yoğun fakat daha yavaş proliferasyon geçirebilirler,

Tümörün yeniden oluşmasına, tedaviye dirençliliğe ve metastaza
neden olurlar.
Kanser kök hücre konsepti Dick ve arkadaşları
tarafından gösterildi.
Çalışmalarında lösemi hücre popülasyonunda
farklı belirteçler taşıyan, tümör oluşturan ayırt
edilebilir hücrelerin varlığını buldular.
Dick, 1994, Nature
Kanser kök hücrelerinin aslında yavaş üreyerek
tedaviden kaçtıklarını açıkladı.
"Most kinds of chemotherapy are designed to
kill fast-growing cancer cells. This is why
leukemia can come back after treatment. To get
rid of the cancer, you have to find ways of
eliminating the stem cells."

Tümör başlatıcı hücrelerin antikanser tedaviye direnç
göstermeleri, genetik ve epigenetik değişim geçirmeleri
hastalığın relapsına neden olur.
Seminars in Cancer Biology 31
(2015) 16–27.
Herceptin targets breast cancer STEM cells
A gene that is overexpressed in 20 percent of breast cancers increases the number of
cancer STEM cells, the cells that fuel a tumor's growth and spread
University of Michigan Comprehensive Cancer Center, Hasan Korkaya, Ph.D, Max S.
Wicha, M.D
HER2 kodlayan genin aşırı ifade edilmesi kanser kök hücrelerinin çoğalmasını ve
yayılmasını tetikler . Meme kanseri dokusunun HER2 pozitif olması ile hastalığın
agresif ve metastatik özellikte olması arasında ciddi bir bağlantı vardır. HER2 hedefli
tedaviyle kanser kök hücrelerin yok edilebildiği gösterilmiştir.
Oncogene.
"This work suggests that the reason drugs that target HER2, such as Herceptin and
Lapatanib, are so effective in breast cancer is that they target the cancer stem cell population.
This finding provides further evidence for the cancer stem cell hypothesis.’’
"We are now studying what pathways are activated by HER2 overexpression. Our hope is
that we could develop inhibitors of these pathways that might be effective in targeting
cancer stem cells in women whose tumors do not overexpress HER2 or those who are
resistant to Herceptin’’
Stem Cell Reports, 2014.
İlaç Dirençliliği ve Kanser Kök Hücreleri
Üzerine Araştırmalarımız
paklitaksel
RPMI 1640
10 % FBS
1.5 % L-Glutamin,
0.1 mg/mL Gentamisin
5 % CO2
37 ºC
MCF-7/400nMPac
MCF-7/S
Sitotoksisite Testleri
XTT
Gen İfade Analizi
Mikrodizin analizi
RT-PCR, QPCR
Hücreler kanser kök
hücre belirteçlerini
taşıyor???
Protein İfade Analizi
Immünsitokimya
Western Blot
Dirençliliğin geri çevirilmesi
çalışmaları (Floresan analizler)
Gene
Spring
GX 7.3.1
Data Analizi
http://www.affymetrix.com/products/reagents/spe
cific/one_cycle_target_control.affx
MDR MCF-7 ve MCF-7/S karşılaştıran gen ağacı
MCF-7 hücrelerinde paklitaksel dirençliliğinde önemli mekanizmalar (Kars et al, 2009)
HÜCRE DIŞI
İLAÇ UYGULAMASI
LAMA
FN
COL4A
COL6A
PAC
İLAÇ
İLAÇ İLAÇ
İLAÇ
IL-32
İNVASIV
ÖZELLİKLER
ADAMTS1
ADAM9
İLAÇ
TIMP4
İLAÇ
İLAÇ
IL-8
IL-6
MDR1
(ABCB1)
HÜCRE ZARI
MRP1
(ABCC1)
ABCG1
IGF1R
TNFR
RAS
EGFR
IL6R
ITGB
PDCD 2/4/6/8/10
İLAÇ
GSTP
GSH
KOLESTEROL
İLAÇ
IGFBP
APOPTOZ
ER
PAC
ETS1
TUBB IZOTİPLER (2,3,4,6)
MAP (1B,4)
TTBK
SİTOPLAZMA
Rb
PROLIFERASYON
RNA Pol.
HÜCRE ÇEKİRDEĞİ
P16
HÜCRE DÖNGÜSÜ
DURUR
CDK2
CYCLIN E
TGFB
FGF
VEGF
MCF-7 HRP-Pgp
MCF-7/Pac HRP-Pgp
Immünositokimya ile MDR1 geninin kodladığı P-gp proteininin
ifade düzeyi belirlenmiştir. (Kars et al, 2010)
Mirodizin analiz sonuçları seçilen bazı gen ve proteinler için
GT-PZR, Western Blot ve Immün-sitokimya teknikleri ile de
doğrulanmıştır.
Sonuçlara göre , MDR1 geni aşırı ifadesinin MCF7/400nMPac hücrelerindeki dirençliliğin en önemli nedeni
olduğu tespit edilmiştir. Bunun yanı sıra ilaçları detoksifiye
eden gluthahion-S-transferaz (GST) enzimini kodlayan gen
(GSTP1) ifade düzeyindeki artışın da hücre hatlarında önemli
bir dirençlilik mekanizması olduğu ve MRP1 proteini
yardımıyla ilaç pompalanmasına katkıda bulunduğu
belirlenmiştir.
Kars MD et al, European Journal of Pharmacology 657 (2011) 4–9
Beta-tübülin izotiplerinin ifade düzeylerindeki değişimler de
paklitaksele karşı gelişen dirençlilik için önemli
görülmektedir.
Apoptotik yolaklarda bulunan, büyüme faktörlerini ve
reseptörlerini kodlayan, tümör mikro çevresinde rol alan ve
hücre döngüsünde etkili olan bazı genlerin ifade
düzeylerindeki değişimler dirençli hücre hatlarında artan
üreme özelliğine katkıda bulunduğu belirlenmiştir.
MDR1 gen
İfadesi, 295bp
MCF-7/CD44 ALDH

MCF-7/Pac

Mikroarray analizleri sonucunda MCF-7/Pac hücrelerinin ALDH,
CD44 ve integrin kodlayan genleri MCF-7/S ile
karşılaştırıldığında aşırı ifade ettikleri, CD24 kodlayan geninin
ifadesinin ise MCF-7/S’ye göre az olduğu bulunmuştur.
Bunun üzerinde MCF-7/Pac hücrelerinde flow sitometri
analizleri yapılmıştır. (FACS Aria III)
ALDH + , CD44 + , CD24 - fenotipindeki hücreler saflaştırılıp
üretilmiştir. Saflaştırılan kök hücre benzeri hücreler Paklitaksele
dirençlidir.
MCF-7/S

MCF-7/Pac, 400nM Paklitaksele dirençli
Akım sitometri ile kök hücre
saflaştırma (CD44+, CD24-/low, ALDH+)
MCF-7/Pac hücrelerinde
P-gp aşırı ifadesi,
MMP protein genleri aşırı
ifadesi,
ALDH aşırı ifadesi,
CD24 ifade düzeyinde azalma
fenotipleri mevcuttur.
NOD/SCID fareye enjekte edilmesi
30 gün sonra tümör oluşumunun
gözlenmesi, histopatolojik analizler.
CD44+, CD24-/low, ALDH+ MCF-7/Pac hücrelerde moleküler
analizler ile dirençli meme kanseri kök hücre
belirteçlerinin belirlenmesi
Dirençli
kök
hücre
belirteçleri hedeflenmesi
ALDH
ALDH
CD44
MCF-7/CD44
MDR dirençliliğinin engellenmesinde genellikle kimyasal
bileşikler, özel antikorlar, deterjanlar kullanılmaktadır.
Pompaları bloke edici moleküller veya ABC taşıyıcı
proteinlerine özel substrat analogları “MDR modülatörleri”
olarak adlandırılır.
Etkili ve toksik olmayan MDR modülatörlerini belirlemek, ilaç
dirençliliğini geri çevirmek için yeni stratejilerin
geliştirilmesine yol açacaktır.
Sarkadi B. et.al, 1997
S
Substrat
SA
Substrat Analoğu
ATP
Monoklonal
antikorlar
Protein
modifiye edici
deterjanlar
ATP
analoğu
P-gp aktivitesinin belirlenmesinde özel floresan boya
kullanılmıştır.
Rhodamine-123 P-gp substratı olan floresan boyadır.
Hücre içinde biriken floresan boya/substrat düzeyleri
akım sitometresi (BD FACS) kullanılarak ölçülmüştür.
Floresan mikroskobunda incelenmiştir.
Counts
Counts
(a)
(b)
FL-1 Height
FL-1 Height
Akım sitometrisi histogramları, rhodamine-123 için:
(a) Duyarlı MCF-7 hücreleri; (b) Dirençli MCF-7 hücreleri
M1: yüksek floresans (FL) bölgesi
M2: düşük floresans bölgesi
Etkenler
Özellikleri
Verapamil
Phenilalkilamin, kalsiyum
kanal inhibitörü
Prometazin
Phenothiazine, kalmodulin
inhibitörü
Kapsantin
Karotenoid, antioksidan,
biber özütünden elde edildi
Saikosaponin
A,D
Bupleurum sp. kök
özütünden elde edilen
saponin türleri
ALIS409 (silikon Sentetik organosilikon
bileşiği)
bileşiği
Kimyasal yapı
Çeşitli doğal ve sentetik maddelerin (saikosaponinler, kapsantin,
verapamil, prometazin, ALIS 409) ilaç dirençliliğini geri çevirme
(P-gp aktivitesini engelleme) potansiyeli araştırılmıştır.
Akım sitometri sonuçlarına göre, P-gp modülasyonu floresan
substratın (Rhodamine123) hücre içinde birikmesine neden
olmuş ve sonuç olarak floresan aktivite değerlerinde artış
görülmüştür.
Floresan birikim analizlerinden elde edilen akım sitometri
histogramları:
Counts
Counts
(a)Dirençli MCF-7 hücreleri; (b) modülatörlerle
dirençliliği geri çevirilmiş dirençli MCF-7 hücreleri
(a)
(b)
FL-1 Height
FL-1 Height
Sonuçlara göre MDR dirençliliği hem MDR1 geninin ifade
düzeyinin azaltılması (prometazin) hem de P-gp’nin bloke
edilmesiyle (saikosaponinler, kapsantin, ALIS-organosilikon
bileşikleri) engellenebilmiştir.
Dirençlilik mekanizmalarının moleküler düzeyde aydınlatılması
ve dirençliliğin geri dönüştürülmesi kanser tedavisinin başarısını
artıracak ve daha etkili ilaç tedavilerini mümkün kılacaktır.
International J Hematology Oncology, 2013, 23:227-232
Chemotherapy, 2008;54:194–200
Anticancer Research, 2006, 26: 4559-4568
PRiMER MEME KANSERİ HÜCRELERİYLE YÜRÜTÜLEN
ÇASLIŞMALAR

Meme kanserli hastaların yaklaşık %20 kadarında HER2
(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) geni
amplifikasyonu olduğu bilinmektedir.

Trastuzumab (HER2 reseptörüne karşı bir monoklonal antikor)
ve diğer HER2 hedefli tedaviler HER2 pozitif meme kanserli
hasta grubunun tedavisine önemli bir katkı yapmıştır.

Meme kanserinde trastuzumabın sadece HER2 pozitif (HER2
aşırı ekspresyonu (+++) veya HER2 gen amplifikasyonu olan)
hastalarda etkili olduğu bilinmektedir. Ancak, HER2 pozitif
hastalarda trastuzumab direnci önemli bir problemdir.

NSABP-B31 (National Surgical Adjuvant Breast and Bowel
Project) çalışmasında trastuzumab ile tedavi edilen ve tedaviye
cevap veren meme kanserli hastaların bir kısmında sonradan
tümör dokuları yeniden incelendiğinde HER2 gen
amplifikasyonu göstermedikleri görülmüştür.

Bu durum laboratuvar hatası olarak açıklanmaya çalışılsa da
sebebi kesin olarak ortaya koyulamamıştır.

Kanser kök hücreleri ile yapılan yeni çalışmalar bu sorunun
cevabına yönelik ipuçları taşımaktadır. Yapılan çalışmalarda
meme kanseri kök hücrelerinin regülasyonunda HER2
reseptörlerinin önemi gösterilmiştir.

In-vitro çalışmalar meme kanseri kök
trastuzumabın etkili olabileceğini göstermiştir.
hücrelerine
Hedef,
Primer meme kanseri kültürlerinden izole edilen kanser kök
hücreleri (benzeri) üzerinde Herceptin (trastuzumab) ,
paklitaksel ve karboplatinin terapötik etkilerini ve kombine
ilaç etkileşimlerini araştırmaktır.
Hasta/doku özellikleri
Hasta
#
ER
PR
CerbB2 R
Moleküler alt grup
H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
Negatif
Negatif
Negatif
Pozitif
Pozitif
Pozitif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Pozitif
Negatif
Pozitif
Negatif
Pozitif (+++)
Pozitif (+++)
Pozitif (+++)
Pozitif (++)(FISHNegatif)
Negatif
Pozitif (++)(FISH Negatif)
Pozitif (+++)
CerbB2 Pozitif
CerbB2 Pozitif
CerbB2 Pozitif
CerbB2 Negatif
CerbB2 Negatif
CerbB2 Negatif
Cerb B2 Pozitif
Cerrahi müdahale ile dokuların alınması
Doku steril olarak antibiyotik ve antimikotik
(amphotericin) ajan içeren besiyerine koyulur
1 saat içinde soğuk olarak hücre kültürü
laboratuvarına transfer edilir.
Hastalardan alınan Meme kanseri dokusudan
primer kültürlerin oluşturulması
Makasla parçalanır
Kolajenaz (300 U/ml) Bir gece
çalkalanır, 37°C
Hücreler filtre edilir(30 μm)
37ºC, 5% CO2’de kültüre
edilir
DMEMF-12, Penicillin / streptomycin
Primer kültürden kanser kök hücrelerin hücre saflaştırmalı
akım sitometri ile izole edilmesi
Hücre CD işaretlerine bağlanması için mouse anti-human CD44-PE, mouse
anti-human CD24-PE-Cy7, mouse anti-human HER2-APC
antikorları (BD
Biosciences) kullanılmıştır. CD44+, CD24- hücreler 2 mL DMEM/F12 besiyerine
seçilerek kültür kabına alınmıştır. Negatif kontrol olarak antikor ile muamele
edilmemiş, 10 μg/mL 7AAD ile boyanmış hücreler kullanılmıştır.
Hasta 3’ün Flow sitometri analizi , ( H3 )
%
Hasta 3 (HER2 pozitif)
Hasta 4 (HER2 negatif)
TOTAL
HER2+
HER2-
TOTAL
HER2+
HER2-
Meme kanseri hücreleri
(CD44+CD24+)
47,7
94,4
5,6
69,9
95,7
4,5
Meme kanseri kök hücreleri
(benzeri)
(CD44+CD24-)
43,7
84,4
15,6
7,7
11,3
87,6
Her iki hastada da HER2 negatif ve HER2 pozitif meme
kanseri kök hücre popülasyonu mevcut.
(AACR Congress, 2015)
CD44 pozitif, CD24 negatif
meme kanseri kök hücre
benzeri primer alt-kültürü % 5.2
ALDH
pozitif
popülasyonu
içermektedir.
Kök hücrelere kemoterapi
uygulanması ve toksisite analizleri
Sitotoksisite analizlerinde XTT kiti kullanılmıştır. Trastuzumab ve kombine
tedavinin hücrelere sitotoksik etkisi 96 gözlü kültür kaplarında test
edilmiştir. İlaç yüksek dozdan düşük doza yatay olarak seyreltilmiştir.
Elde edilen sonuçlar HER2 pozitif ve HER2 negatif meme kanseri kök
hücrelerinin trastuzumab ve kombine tedavilere cevabı yönünden
değerlendirilmiştir.
Primer Kültürlerinde Kombine Tedavinin Etkileri
Sitotoksisite Testi, IC50 değerleri

Hastalarda dokularından elde edilen primer meme
kanseri kök hücre kültürlerinde HER2 pozitif ve
HER2 negatif kök hücre benzeri popülasyonların
birlikte bulunduğu gösterildi.

Trastuzumab, HER2 pozitif kök hücre benzeri
popülasyona en etkilidir. Toplam primer kültür
Transtuzumab’a aynı ölçüde yanıt vermemiştir.
Sonuçlar meme kanserinde ilaç direnci
nedenlerini
aydınlatmak ve HER2 histopatoloji sonucuna yönelik
tedavilerin yanıtlarını değerlendirmek açısından oldukça
umut vericidir.
KKH hedefleme alanında son zamanlarda yapılan
araştırmalar ise Nanoteknolojik ilaç sistemleri tasarlayıp
KKH’leri hedeflemeyi amaçlamaktadır.
ACS Nano. 2015 Jun 23;9(6):5725-40. doi: 10.1021/nn506928p. Epub 2015 May 29.
Chitosan-Decorated Doxorubicin-Encapsulated Nanoparticle Targets
and Eliminates Tumor Reinitiating Cancer Stem-like Cells.
Rao W 1,2, Wang H1,2,3, Han J3,4, Zhao S1,2, Dumbleton J1,2, Agarwal P1,2, Zhang
W 5, Zhao G6, Yu J3,4, Zynger DL7, Lu X8, He X1,2,3.
Abstract
Tumor reinitiating cancer stem-like cells are responsible for cancer recurrence associated
with conventional chemotherapy. We developed a doxorubicin-encapsulated polymeric
nanoparticle surface-decorated with chitosan that can specifically target the CD44
receptors of these cells. This nanoparticle system was engineered to release the
doxorubicin in acidic environments, which occurs when the nanoparticles are
localized in the acidic tumor microenvironment and when they are internalized and
localized in the cellular endosomes/lysosomes. This nanoparticle design strategy
increases the cytotoxicity of the doxorubicin by six times in comparison to the use of
free doxorubicin for eliminating CD44(+) cancer stem-like cells residing in 3D
mammary tumor spheroids (i.e., mammospheres). We further show these nanoparticles
reduced the size of tumors in an orthotopic xenograft tumor model with no evident
systemic toxicity. The development of nanoparticle system to target cancer stem-like cells
with low systemic toxicity provides a new treatment arsenal for improving the survival of
cancer patients.
TEŞEKKÜRLER
Selçuk Üniversitesi
İleri Teknoloji Araştırma ve
Uygulama Merkezi
Konya N.E. Üniversitesi
Meram Tıp Fakültesi
Doç. Dr. Mehmet Artaç
GATA
Prof. Dr. Fikret Arpacı
Prof. Dr. Ali Uğur Ural
ODTÜ
Prof. Dr. Ufuk Gündüz
TUBİTAK
106S019, 113S559
University of Szeged
Prof. Dr. Jozsef Molnar